Cancer biomarkers: Emerging trends and clinical implications for personalized treatment
作者：Antonio Passaro 等
癌症生物标志物的整合已经彻底改变了肿瘤学，为癌症治疗和癌症患者的预后带来了显著的进步。个性化医学的发展代表了癌症管理的一个转折点和新范式，因为生物标志物使肿瘤学家能够根据每个患者肿瘤的独特分子特征来定制治疗方案。在这篇综述中，我们讨论了癌症生物标志物的科学里程碑，并探索了改善实体瘤患者管理的未来可能性。这一进展主要归功于癌症的生物学特征、测试方法的进步、免疫微环境的阐明，以及循环肿瘤分数的分析能力。整合这些见解承诺将继续推进精准肿瘤学领域，促进更好的患者结果。生物标志物是指在血液、体液或组织中发现的任何生物学标记，它表明正常或异常的生物学过程、状况或疾病的存在。当应用于肿瘤学领域时，癌症生物标志物具体识别癌症的特征，理想情况下具有高度的准确性和可靠性，报告为它们的敏感性和特异性。癌症生物标志物的使用不仅限于确定患者所患癌症的类型。事实上，一旦确诊，肿瘤标志物可以提供有关疾病可能进展的有价值的见解，包括复发的可能性和治疗预期结果。癌症生物标志物在独立于任何治疗的疾病预后（称为预后生物标志物）中发挥关键作用，或在预测癌症将如何响应特定治疗方面（称为预测性生物标志物），这有助于预测治疗结果。已经鉴定出许多癌症生物标志物，并主要根据蛋白质的存在进行分类，这些蛋白质属于不同的功能类别，如酶、激素、抗原和受体。癌症相关基因的改变，包括单基因水平上的突变、扩增和易位，或通过微阵列创建遗传档案，导致独特的遗传特征。这些变化有助于癌症生物标志物的识别和分类，有助于理解这种疾病并进行治疗。无论其类型如何，理想的癌症生物标志物特征包括简单、可重复、可靠和成本效益高的检测方法，所有这些方法都应与患者结果的明显改善相关。本综述将探讨癌症生物标志物的当前应用和未来前景，同时考虑测试技术的进步和对肿瘤生物学更深刻的理解。讨论将涵盖这些发展如何有助于在癌症诊断、预后和治疗规划中有效使用生物标志物。这种更广泛的观点旨在激发对更好的肿瘤学生物标志物对患者护理、医疗保健系统和社会福祉变革性影响的兴奋。癌症生物标志物的发现和开发是通过精心探索不仅在组织中，也在癌症患者生物液体中的各种物质，包括激素、酶和蛋白质。这些标记物主要是通过引入免疫技术，如放射免疫分析发现的。生物科学领域的快速发展显著推动了技术进步。几十年来，这一进展导致了复杂分析方法的出现，特别是在质谱和蛋白质及DNA阵列的开发方面。这些方法与生物标志物发现领域内的特定时代和分类紧密相关。基因组测序是一个关键的进展，它显著增强了对癌基因和肿瘤抑制基因（TSGs）的识别。这促进了癌症生物标志物的发现，现在它们作为筛查、诊断、预后和预测的全面工具。最初基于经验观察的癌症生物标志物研究已经随着现代测试技术的发展而发展。从串联到并行测试的转变使多重标记的同时识别成为可能，提供了对复杂疾病模式的见解。当今的癌症生物标志物包括多种元素，包括DNA、RNA、蛋白质、代谢物和动态过程，如凋亡和血管生成，展示了丰富的属性和组合模式。在生物标志物评估和发展过程中，临床前筛选使用基因表达分析或质谱来识别潜在的癌症标记物。发现后，开发一种临床检测方法，以非侵入性方式在肿瘤组织或生物液体中检测选定的生物标志物，区分阳性和阴性结果。这种检测方法应用于临床研究中，用于筛查（例如，在前列腺癌中血清前列腺特异性抗原[PSA]）、诊断（例如，在没有组织学确认的情况下识别疑似肺癌中的表皮生长因子受体[EGFR]突变）、预后（例如，在乳腺癌中的激素受体状态）和预测治疗反应（例如，在各种肿瘤中的免疫治疗的基因特征）。尽管研究设计偏见和技术假象影响了单一癌症生物标志物的历史，它们在诊断（例如，在骨髓瘤中的Bence-Jones蛋白）、预后（例如，在睾丸癌中的人类绒毛膜促性腺激素[hCG]）和预测治疗结果（例如，在肺癌中指导治疗的间变淋巴瘤激酶[ALK]基因重排）中找到了应用。理想的癌症生物标志物应该具备易于、可靠、成本效益高的评估属性，并具有高灵敏度和特异性。此外，它应该在早期阶段表现出显著的可检测性，并准确反映肿瘤负担，使疾病在治疗过程中的演变能够持续监测。然而，它们的低诊断特异性是一些生物标志物，特别是旧的基于血液的生物标志物，如癌胚抗原（CEA）或癌症抗原Ca125和Ca15-3，在现实世界应用中的一个重要限制。这种限制源于它们可能由非肿瘤组织表达，引入了误解的风险。这种限制的影响是多方面的。首先，存在患者因需要更精确的诊断而接受错误或不必要的治疗的风险。这带来了潜在的健康风险，并引发了与无效干预相关的经济负担的担忧。此外，这些生物标志物的低特异性可能导致实际癌症病例的忽视，导致诊断延迟或漏诊。这种诊断的延迟可能显著影响患者的结果和总体生存率。如果对成本效益和对医疗预算总体影响存在担忧，医疗系统可能会不愿投资或将这些生物标志物整合到常规筛查和诊断中。通过深入探讨这些观点，可以构建一个更全面的情况，以强调推进肿瘤学生物标志物的紧迫性和重要性。改进的生物标志物可以提高癌症诊断和治疗的准确性，并通过对不必要的干预进行最小化，优化医疗资源配置，从而有助于经济效率。尽管与单一标记评估相关的潜在缺点，例如在预后或预测角色中的特异性较低，与全面方法（如评估共同发生的基因改变模式）相比，它们继续使用的实用原因。当资源有限或简单的诊断或预后工具足够时，分析单一标记的简单性和成本效益使它们具有吸引力。一些单一标记已经经过广泛的临床验证，展示了它们在特定背景下的可靠性和准确性。这些经过充分验证的标记可能继续在常规临床环境中发挥关键作用，其中它们的临床效用已经牢固建立。因此，尽管承认局限性，单一标记的实用优势和经过验证的功效支持它们在特定的分子诊断和个性化医学应用中的持续相关性。这也适用于免疫生物标志物，今天它们作为癌症治疗中不可或缺的工具，提供了指导治疗决策并增强免疫疗法有效性的见解。通过评估诸如程序性死亡配体1（PD-L1）表达、肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）和肿瘤微环境中的分子特征等因素，临床医生可以预测和监测对免疫疗法的反应。此外，像微卫星不稳定性和错配修复缺陷这样的生物标志物有助于识别更有可能从免疫检查点抑制剂中受益的患者。免疫生物标志物的作用不仅限于预后；它们在塑造个性化和针对性方法中发挥关键作用，促进了对免疫系统与癌细胞之间复杂相互作用的深入理解。随着我们对这些生物标志物的理解的不断发展，它们在临床实践的整合承诺优化癌症治疗策略并改善患者结果。从这个角度来看，泛癌症方法将获得有关能够预测肿瘤抗原识别和T细胞反应启动的免疫签名的可靠性。此外，相同的生物标志物在不同的肿瘤和不同的药物中可能有不同的作用。例如，人表皮生长因子受体2（HER2）的突变、扩增和过度表达分别是肺癌、乳腺癌和胃癌的特定生物标志物，因此需要相应的不同测试方法。相反，不可知论方法代表了两种情况的范式转变：同一生物标志物（例如，神经营养性酪氨酸受体激酶（NTRK）基因重排）在不同类型的肿瘤中，以及靶向药物的生物标志物不可知论使用。后一种方法是基于不同肿瘤类型的抗体-药物偶联物（ADCs）的出现的基础。实际上，ADCs使用通常出现在肿瘤细胞上而不是健康细胞上的目标抗原，更有选择性地在肿瘤部位输送细胞毒素药物。因此，需要肿瘤细胞上的目标存在-根据历史数据，但其作为生物标志物的特定量化不是必需的。目前可用的ADCs的活性在大多数肿瘤中被证明是无论目标在大多数肿瘤中的表达水平如何，不同的目标（例如，TROP2，HER3）以及评估的ADCs。这个关键的考虑导致了以前被排除的生物标志物的重新利用，就像新发现的“HER2低表达”乳腺癌在接受ADC trastuzumab-deruxtecan治疗中受益一样。作为一个重要的信息，提升癌症生物标志物研究需要向多参数方法转变，结合动态过程和免疫签名。在不损害特异性的情况下拥抱简单性将推动可靠、成本效益高的生物标志物的发展，在个性化癌症诊断和治疗中提供变革性的潜力。从癌基因到多维生物学评估：生物标志物指引的治疗决策制定免疫组化（IHC）或聚合酶链反应（PCR）由于成本低廉和速度快仍然是标准的基本工具。然而，使用二代测序（NGS）技术，能够快速且成本效益高地测序大量的DNA或RNA，特别是在结直肠癌和非小细胞肺癌以及黑色素瘤等特定癌症类型中逐渐增加。近期的癌症研究进展利用了先进的基因分析技术，如全外显子测序（WES）、全基因组测序（WGS）和RNA测序（RNA-seq）。WES深入研究编码蛋白质的DNA区域，揭示了癌症中的相关遗传变化。WGS采取了更全面的方法，对整个DNA进行测序，包括非编码区域，提供了遗传景观的整体视图。RNA-seq仔细研究RNA分子，以解码基因表达模式。这些方法共同推进了我们对肿瘤途径的理解，有助于改进靶向诊断和治疗。当目标版块 (targeted panels) 未能识别可行的分子异常时，扩大范围变得特别相关。传统上，对分子机制的见解为开发专门针对这些机制的药物铺平了道路。通常，这些药物在癌症生物学由药物靶向的特定蛋白质驱动的患者中证明是有效的。一个著名的例子是针对乳腺癌患者的雌激素受体（ER）和HER2。先进的基因分析技术扩展了我们对癌症相关过程的理解。一种这样的方法是结合WES或WGS研究DNA，以及RNA-seq分析RNA分子。在牛津元分析中，使用内分泌疗法，特别是他莫昔芬，一种ER调节剂，在表达ER的早期乳腺癌患者中显著减少了三分之一的乳腺癌死亡率。相反，在没有ER表达的患者中没有观察到任何益处。这段历史背景为癌症治疗的发展提供了基础，其中生物学特征和基因组学已成为识别推动癌症进展的关键癌基因的重要工具。值得注意的是，基因组分析在揭示这些复杂的分子档案中发挥了重要作用。历史上的例子，如乳腺癌中的HER2扩增、肺癌中的EGFR突变、胃肠道间质瘤中的cKIT突变和黑色素瘤中的BRAF突变，突显了基因组洞察对治疗策略的影响。在这些情况下，使用HER2、EGFR、KIT和BRAF信号抑制剂的靶向疗法显著改善了携带这些基因组改变的转移性癌症患者的结果。基因组分析与靶向疗法之间的相互作用突出了理解分子复杂性在指导有效的癌症干预中的变革潜力。这允许最佳生物活性与最小毒性。进一步的例子是针对特定的KRAS G12C突变和542/545/1047 PIK3CA热点突变的药物。进一步的先进基因分析包括检测更复杂的基因组改变，如基因融合和检测推动癌症进展的生殖系改变。基因融合已被描述并用作伴随诊断已经很久了。例如，急性髓系白血病中的PML-RAR融合定义了一组对视黄酸和砷有异常敏感的患者。在过去的几年中，几种基因融合已被确定为驱动改变，现在代表了治疗决策的生物标志物。这包括成纤维细胞生长因子受体基因2（FGFR2）、NTRK、ALK、转染期间重排（RET）、Ros原癌基因酪氨酸蛋白激酶（ROS1）和NRG融合。尽管测试和靶向癌基因现在是一种既定策略，但靶向肿瘤抑制基因（TSGs）仍然是一个主要挑战。针对与TSGs相关的挑战，出现了各种策略。合成致死性对于BRCA突变癌症来说是一个重大突破，证明了在BRCA1/2突变的乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌患者中使用PARP抑制剂在提高结果方面取得了显著成功。这种方法展示了针对特定遗传弱点的潜力。在另一种方法中，使用药物阻断由TSGs丢失激活的途径，如在PTEN突变和转移性乳腺癌患者中使用AKT抑制剂。检查这些生物标志物在靶向TSGs的背景下是必要的。例如，前面的例子强调了通过靶向经过验证的驱动癌基因可以改善患者结果。然而，解决这些挑战需要对生物标志物与重新激活突变TSGs相关的复杂机制之间的相互作用有微妙的理解。首先，大多数患者不可避免地会出现治疗抗性。一些导致替代信号或反馈循环的共同突变或蛋白表达解释了基因组驱动的靶向疗法的原发性抗性。例如，KRAS突变解释了在转移性结直肠癌患者中对EGFR抑制剂的抗性。这导致了KRAS突变作为抗性生物标志物的识别，并且现在已在常规实践中进行。相反，EGFR表达已被报道在结直肠癌患者中介导对BRAF抑制剂的抗性。随后，在结直肠癌患者中靶向EGFR现在是优化使用BRAF抑制剂的强制性治疗。例子比比皆是，例如在黑色素瘤患者中同时使用MEK抑制剂和BRAF抑制剂。获得性抗性通常源于新的改变的出现，这些改变赋予了对靶向疗法的抗性。在EGFR抑制剂治疗后EGFR T790M突变的发展是一个历史性的例子。最近的例子包括在接受内分泌治疗的乳腺癌患者中ESR1突变的出现，在接受抗雄激素治疗后AR融合的出现，或在接受PARP抑制剂治疗后BRCA突变的逆转。这些突变是来自预先存在的亚克隆还是由靶向疗法暴露引起的辩论仍在继续，这两种现象很可能都有助于癌症的发展。在靶向疗法暴露之前检测预先存在的抗性亚克隆可能对精准医学产生深远影响，通过阐明肿瘤可能发展的最终抗性机制。针对这些二次突变的药物已经显示出在结果上具有临床意义的改善。其中一些化合物现在已经转变为一线设置，目的是在有效靶向初始驱动突变的同时，预先防止二次抗性。作为一个例子，奥希替尼，一种第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂，最初是为靶向常见的EGFR T790M抗性突变而开发的，并且现在在一线设置中给予EGFR激活突变的治疗未经过的患者。这个领域的下一个挑战将是阻止导致下一种抗性类型的突变过程。系统和常规地检测这些基因组改变在日常实践中代表了第二个挑战。基因组测序是评估前述基因组改变的金标准，执行它的最快和最便宜的方法是进行多基因测序，该方法可以在单一检测中评估所有改变。多基因测序的临床效用已经得到验证，这项技术现在被推荐用于大多数癌症类型。最近的几个试验表明，基因组检测的解释应该由专门的框架驱动，如ESCAT（欧洲医学肿瘤学会[ESMO]分子靶标的临床行动能力量表）或ONcoKb（肿瘤知识库），并且只有经过验证的基因组改变才应该被考虑用于日常实践。生物分子技术在日常临床实践的可用性和使用仍然是多样和多因素的，无论是在国内还是跨国。经济问题、获取障碍和卫生系统差异限制了它们的系统解释。最近的ESMO调查提供了一个全面的概述，关于WHO欧洲区域国家的患者在世界范围内可获得和可访问的生物分子技术，正式证明全面的NGS面板在临床常规实践中仍然基本上不可获取，并且限于临床和转化研究，即使是在欧盟和美国地区。第三个挑战是改变与基因组驱动的靶向疗法开发相关的框架。尽管这些药物靶向基因组改变，有时表现出卓越的疗效，但它们仍然使用历史上的随机试验在按起源器官（即，乳房、结肠...）定义的疾病中开发，这种分类现在被认为基本上是不够的。使用单一臂第二阶段试验和跨肿瘤类型的药物开发可以显著加快药物开发和治疗的获取。例如，TRK抑制剂在对起源器官不知情的单一臂第二阶段试验中被证明是有效的。比较罕见疾病的单一臂试验的证据，并且在高度有效的结果情况下，与合成匹配的真实世界证据臂相比，可以加快精准肿瘤学策略的注册。这种方法旨在提高药物获取和改善更广泛疾病谱患者的护理。为了改进生物标志物驱动的疗法，最后一个挑战是增强基因组测序与更广泛的生物学评估相结合，以提高准确性并解决肿瘤异质性，特别是表征共同突变。正在开发几种技术来满足这些需求。来自空间生物学和基于类器官的体外模型等先进技术的空间洞察在为生物标志物驱动的疗法改进药物开发中发挥关键作用。通过将基因组测序与全面的生物学评估相结合，这些见解有助于提高准确性和解决肿瘤异质性，特别是在表征共同突变方面。这种空间信息使开发具有更定制化治疗策略的药物成为可能，优化它们在解决个体病例复杂性方面的有效性。将评估整合到多维评分中承诺了对疾病生物学在个体患者随时间的细微理解，预示着精准医学的新时代。总之，从癌基因到像WES、WGS和RNA-seq这样的先进基因分析技术的癌症研究的演变已经阐明了分子途径的复杂性，促进了靶向疗法。尽管取得了成功，但挑战依然存在。确定抗性的预测生物标志物、实施常规基因组测试、重新定义药物开发框架以及采取多维方法补充基因组学是关键的前沿。弥合这些差距承诺加速药物开发，提高治疗精度，并全面理解癌症生物学，最终重塑精准医学的格局。临床生物标志物测试依赖于检测由肿瘤产生或作为对肿瘤反应的分子，如DNA、RNA、蛋白质代谢物或转录因子，这些分子可以帮助诊断，并提供预测性和预后信息以指导患者护理。随着努力开发使用新的分析测试方法的敏感和特异性生物标志物，分子技术的发展促进了精准肿瘤学的生物标志物分析领域的增长。下面描述了一些在临床诊断实践中常用的测试方法，并在表1中显示。
IHC是一种广泛可用的、快速且相对便宜的检测方法，用于检测组织样本中特定细胞表达的蛋白质。尽管自20世纪40年代以来，IHC一直在可视化抗原-抗体相互作用方面得到应用，通常与酶（如过氧化物酶）结合使用（色素IHC），但也可以采用其他技术，例如标记到荧光团（免疫荧光）、多重IHC使用不同的抗体来染色同一组织切片、多重免疫荧光（mIF）以及更新的技术，如酪胺信号放大和荧光量子点纳米晶体，具有更高的灵敏度，可用于检测和定量特定蛋白质表达。例如，IHC是评估乳腺癌中ER的推荐检测方法，ER是第一个建立的预测生物标志物，也是在乳腺癌患者中考虑内分泌治疗最广泛使用的预测标记。其他预测/预后IHC基础生物标志物，如孕酮受体（PR）、HER2、Ki-67、ALK、ROS1、DNA错配修复蛋白、NTRK和PD-L1，通常用于多种实体瘤的临床实践。ELISA是临床实践中用于检测和测量抗体、抗原和蛋白质的常用免疫学测定方法，特别是在血液和其他体液中。新技术，如电化学ELISA，提高了检测低丰度蛋白生物标志物的灵敏度。一些常用的ELISA检测方法包括用于检测前列腺癌患者中的PSA和胰腺癌/结直肠癌患者中的CEA。FISH是另一种常用的技术。它使用荧光标记的探针，可以与核酸序列杂交，以检测肿瘤细胞中的基因拷贝数变化（例如，扩增）或基因重排/融合。FISH技术的额外用途，用于检测诊断、预测和预后生物标志物，包括多重FISH和比较基因组杂交。评估HER2扩增的最广泛使用的基于FISH的生物标志物检测之一。HER2在高达20%-30%的乳腺癌患者中过度表达，以及在包括胃癌和胃食管癌、结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌在内的其他几种恶性肿瘤中。尽管HER2可以通过IHC可靠评估，但IHC中的中间染色（2+）需要用FISH进行测试以澄清结果。其他预测/预后FISH基础生物标志物，经常用于临床实践的包括ALK、ROS1和NTRK、RET和MET原癌基因，受体酪氨酸激酶（MET）。PCR基础基因组分析是肿瘤学中DNA和RNA应用最常用的分子方法。PCR基础扩增结合测序已广泛用于检测各种肿瘤类型的DNA突变、基因融合、拷贝数变化和DNA甲基化分析。包括实时PCR和数字PCR在内的各种修改已在临床实践中使用，以提高检测生物标志物的灵敏度。NGS结合独特的测序化学和生物信息学，允许大规模并行测序，具有高吞吐量和可扩展性。NGS常规用于检测DNA基础测试的生殖系变异和体细胞突变，以及RNA基础生物标志物，如基因融合和RNA-seq。NGS可以采用基于扩增子的方法，使用引物面板扩增包含驱动突变的基因片段，或使用捕获探针对感兴趣的区域进行目标捕获和杂交测序。在过去的几十年中，对于更广泛的生物标志物测试的需求不断增长，以根据肿瘤的特定分子和免疫特征定制治疗。因此，在面对对更复杂的生物标志物信息的不断增长的需求时，像基于NGS的检测这样的全面基因组分析平台比单基因测试更受青睐。几种基因表达分析检测方法目前用于评估基因表达和转录组变化，以将肿瘤分类为分子亚型，用于预测或预后目的。基因表达微阵列通常用于评估肿瘤样本中的不同基因表达，并用于评估预后和疾病复发，并可作为治疗反应的预测生物标志物。基于微阵列的乳腺癌分子分类用于预测复发风险和化疗反应。总体而言，分子技术的进步推动了精准肿瘤学中的生物标志物分析。尽管传统方法仍然盛行并增加了新工具，但IHC、ELISA、FISH、PCR和NGS都是重要的工具，每种工具都发挥着独特的作用。从蛋白质检测到全面的基因组分析，这些技术有助于精准医学的发展，为定制化治疗方法提供了见解，并增强了我们对肿瘤生物学的理解。肺癌是非小细胞肺癌（NSCLC）免疫治疗中用于表征免疫反应的生物标志物开发的关键例子。免疫治疗在治疗早期、局部晚期和转移性非小细胞肺癌中已变得日益重要。尽管免疫检查点抑制剂的使用带来了无进展生存期和总生存期的益处，但能够实现持久疾病控制的患者数量是有限的。因此，使用生物标志物进行分层以避免对患者的过度和不足治疗是重要的。常用的生物标志物包括PD-L1状态、肿瘤突变负担（TMB）以及最近新辅助化疗免疫治疗后的病理反应。然而，这些生物标志物各有局限性，随着我们对癌症-免疫相互作用的理解不断发展，新的潜在生物标志物正在出现。这些生物标志物可以广泛地分类为肿瘤细胞固有的或与微环境相关的。这些标记的最佳整合，特别是与疫苗、T细胞受体结合物和细胞疗法等新兴免疫疗法结合使用时，仍有待确定（图1）。
图1. 用于表征非小细胞肺癌（NSCLC）中免疫反应的生物标志物示例。 宿主、癌细胞和肿瘤微环境特征已被证明与免疫浸润和/或对基于免疫疗法的敏感性有关。这些类别中与提高敏感性和/或免疫细胞浸润相关的特征包括但不限于宿主基因中的多态性，如RBL1，高体细胞克隆肿瘤突变负担（TMB），以及低的外周血中性粒细胞与淋巴细胞比率。相反，与降低敏感性和/或免疫浸润相关的特征示例包括HLA-B44基因型、某些基因（例如STK11）的体细胞变异，以及M2型巨噬细胞的存在。免疫系统能够识别多种肿瘤抗原，包括体细胞突变衍生的新生抗原、肿瘤病毒抗原（例如HPV E6）、谱系相关蛋白（例如黑色素瘤中的Melan-A）和癌-睾丸抗原。TMB反映了潜在新生抗原库的大小，已被证明是免疫检查点抑制剂诱导的T细胞反应的目标。据估计，≤1%–5%的体细胞突变产生免疫原性新生抗原。因此，较高的TMB增加了产生免疫原性新生抗原和有效T细胞反应的可能性。具有高突变负荷的癌症，如NSCLC、头颈癌、黑色素瘤、尿路上皮癌和小卫星不稳定肿瘤，通常对免疫疗法反应良好。TMB评估对免疫疗法的反应具有预后意义，FDA已批准将pembrolizumab用于高TMB实体瘤（定义为使用FoundationOne CDx检测≥10个突变/兆碱基）。使用TMB作为生物标志物的一个主要挑战是如何定义不同面板设计和生物信息学管道的TMB高肿瘤的截止值。尽管已经证明了基于血液的TMB测量的可行性，但这些检测不能在非循环肿瘤DNA（ctDNA）释放疾病中使用，并且在低ctDNA释放疾病中可能不准确。为了在临床检测中标准化TMB计算，正在进行努力。最近的进展强调，并非所有体细胞突变都是平等的。癌症在整个生命周期中不断获得体细胞突变，有些是“克隆的”（存在于每个细胞中），有些是“亚克隆的”。克隆新生抗原负担与NSCLC患者使用免疫检查点抑制剂治疗的持久反应相关。此外，克隆TMB是在预测放射学肿瘤反应方面效果最大的生物标志物，涵盖了1,008种免疫检查点抑制剂治疗的癌症（CPI1000队列），包括NSCLC、黑色素瘤、肾脏、尿路上皮、乳腺、结直肠和头颈癌。相比之下，亚克隆TMB与肿瘤对免疫治疗药物（例如免疫检查点抑制剂）的反应没有显著关联，这表明TMB的克隆部分可能在免疫治疗反应中至关重要。突变的类型和驱动突变的起源对于免疫检查点抑制剂的反应也很重要。插入/缺失（INDELs），特别是移码变体，可以每个变体产生比非同义突变更高的亲和性新生抗原。INDEL TMB和通过无义介导的衰变逃逸的移码INDEL负担与免疫检查点抑制剂反应相关。吸烟突变特征的存在也与CPI1000队列的肺部亚组中的免疫检查点反应相关，独立于TMB负担。这可能反映了与吸烟相关的二核苷酸突变负担，增加了改变两个氨基酸和/或引起更根本的氨基酸替代的可能性，以便免疫系统检测。NSCLC中另一个感兴趣的抗原来源是癌-睾丸抗原（CTAs），例如黑色素瘤抗原基因（MAGE）、黑色素瘤优先表达抗原（PRAME）或纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）。它们是免疫原性的，通常在NSCLC中表达，并且在正常组织中的表达限制在拥有生殖细胞的免疫特权部位。已经开发了现成的疫苗和细胞疗法来针对这些在多种癌症类型中的抗原，检测这些抗原通常是招募到此类临床研究的先决条件生物标志物。除了作为潜在的新生抗原外，一些体细胞改变可能会赋予对免疫检查点抑制的不同敏感性。例如，由EGFR和ALK驱动的肺癌与对检查点抑制剂的抗性有关。尽管这可能部分与非吸烟者患者中TMB的减少有关，但非炎症肿瘤微环境、减少的肿瘤浸润性淋巴细胞和减少的干扰素γ（IFNγ）特征也可能促成这种不敏感性，以及激活CD73腺苷途径，作为EGFR突变NSCLC的潜在治疗靶点。关于EGFR突变癌症中PD-L1表达的文献存在冲突，尽管汇总分析表明，与EGFR野生型癌症相比，PD-L1表达可能减少。相反，MET外显子14跳跃突变与高PD-L1表达相关，并且TP53/KRAS共突变NSCLC与对检查点阻断的增加敏感性相关。然而，如果KRAS突变肿瘤也携带STK11突变，这与PD-L1水平降低相关；或者如果它携带KEAP突变，那么与T细胞浸润减少和炎症细胞因子下调相关。这两种变异都与免疫检查点抑制的较差临床结果相关。同样，PTEN的丧失与免疫抑制趋化因子的增加表达、T细胞浸润减少、IFNγ表达减少以及在黑色素瘤和NSCLC中PD-1靶向治疗的较差结果相关。DNA损伤修复途径中的突变，如POLE、POLD1和MSH2，也与对免疫检查点抑制剂的反应相关，可能反映了增加的TMB。BRCA1/2和其他同源修复途径中的基因突变，以及MUTYH中的突变，与增加的TMB和TILs相关。泛癌症分析还表明，某些基因的拷贝数增加和减少可能与对检查点阻断的敏感性改变有关；例如，CCND1扩增与抗性相关，而9q34.3缺失，包括TRAF2，与敏感性增加相关。这些例子展示了肿瘤的基因组背景作为免疫检查点阻断反应的生物标志物的潜在效用。肿瘤细胞采用各种免疫逃逸策略，影响免疫治疗的反应性。这些包括增加PD-L1表达、改变抗原呈递机制（例如B2M或人类白细胞抗原[HLA LOH]的杂合性丧失）和失去IFNγ敏感性。PD-L1表达是NSCLC免疫治疗的临床验证生物标志物，但不是SCLC。目前有三种FDA批准的PD-L1 IHC检测方法作为伴随诊断使用：Dako 28-8用于NSCLC中ipilimumab/nivolumab的使用；Dako 22C3用于多种实体瘤中pembrolizumab的使用；Ventana SP142用于NSCLC、尿路上皮恶性肿瘤和三阴性乳腺癌中atezolizumab的使用。在晚期NSCLC中，如果没有驱动EGFR和ALK变异，PD-L1≥1%的截止值目前用于确定是否适合使用nivolumab/ipilimumab联合治疗或pembrolizumab单药治疗；PD-L1≥50%的截止值用于确定是否适合使用atezolizumab单药治疗或cemiplimab单药治疗。有趣的是，高PD-L1表达似乎与高TMB没有显著关联，这表明这两种生物标志物的组合可能比单独使用任何一个更好。抗原处理和呈递途径的异常与对检查点阻断较差的反应有关。从包括B2M、CALR、NLRC5、PSMB9、PSME1、PSME3、RFX5和HSP90AB1在内的基因表达数据生成的“抗原处理机器”评分与NSCLC中对检查点阻断的反应相关。编码β2-微球蛋白的B2M突变，是主要组织相容性复合体I类（MHC I）分子的细胞外成分，稳定MHC I在细胞表面表达，并在向免疫系统呈递抗原肽中发挥作用，已涉及黑色素瘤和NSCLC中对免疫疗法的获得性抗性。因此，识别B2M中的这些变化可能为对检查点阻断的反应提供重要的生物标志物。癌细胞减少新生抗原表达的另一种策略是通过丢失包含免疫原性突变的基因组片段，或通过基因组丢失或抑制HLA等位基因表达。NSCLC肿瘤的研究表明，B2M突变倾向于与HLA LOH以及其他抗原呈递机制组成部分的变化互斥。HLA LOH的存在在“免疫热点”肿瘤中富集，表明这是一种免疫逃逸机制。因此，在设计针对疫苗和基于细胞的疗法等个性化新生抗原靶向治疗时，了解HLA等位基因的表达将尤为重要。JAK1和JAK2基因编码对IFNγ做出反应的信号转导蛋白，通过增加抗原呈递、产生吸引T细胞的趋化因子和触发肿瘤细胞凋亡。JAK1/2信号还导致PD-L1表达增加，从而允许逃避T细胞介导的细胞毒性。因此，JAK1/2中的突变或丢失将导致对IFNγ信号的响应减少，肿瘤生长增加，T细胞浸润减少，以及使用PD-1/PD-L1靶向药物的无效性。实际上，JAK1/2突变与黑色素瘤中对检查点阻断的原发性抗性相关。肿瘤微环境包括免疫细胞和基质细胞。各种免疫细胞，如TILs、调节性T细胞、B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞，在促进或抑制肿瘤生长中的作用正在研究中。这些细胞的存在及其相关的趋化因子分泌特征正在被开发成潜在的免疫治疗反应生物标志物。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，研究最多的与微环境相关的生物标志物之一是肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）的浸润。研究结果表明，高浸润水平，特别是CD8+细胞的浸润，与更好的总体结果相关，并且与对免疫检查点阻断的敏感性增加有关。TILs与免疫检查点阻断的反应之间的相关性比PD-L1阴性疾病患者中的肿瘤突变负担（TMB）水平更为显著。研究正在探讨是否通过对PD-1或CD39等共表达标志物的染色增强TILs评估，可以优化这些生物标志物对免疫治疗药物反应的预测性能。TILs通过简单的H&E染色片可以被病理学家评估，这有助于无缝集成到临床实践中，类似于在乳腺癌中建立的用途。相反，其他细胞，如调节性T细胞、M2型巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞（例如中性粒细胞），与免疫抑制环境相关。高水平的基线中性粒细胞-淋巴细胞比率或低嗜酸性粒细胞计数等循环标志物似乎与检查点阻断的较差结果相关，并且也可以容易地纳入临床实践。为了考虑免疫微环境中的多种细胞类型，以及它们的激活和趋化因子信号，已经开发了多个转录组签名来预测对检查点阻断的反应。这些签名在所使用的平台、评估的基因数量和涉及的途径方面各不相同：从T细胞激活和细胞毒性活性，到IFNγ信号，到抗原处理，以及B细胞反应。纳入这些小组的趋化因子包括CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13和IFNγ。CPI1000队列中的泛癌症分析确定CXCL13在对检查点阻断有反应者与无反应者中高度且差异性表达，而CXCL9与其他肿瘤浸润标志物相比，在与反应相关性方面具有最大的效应大小。与宿主相关的因素也在对检查点阻断的敏感性中起作用。例如，生物学上的男性性别在考虑检查点阻断时似乎有益处。几种生殖系遗传变异似乎有助于免疫特征。据估计，T细胞浸润和IFNγ信号的15%-20%的肿瘤内变异是可遗传的。例如，RBL1中的多态性与T细胞浸润相关，IFIH1、STING1和TMEM108中的多态性似乎影响IFNγ信号。IFT74、DCDC2和NRSN1中的多态性也与改变的CD8+ T细胞表型相关，而CTLA4、CCR5、IRF5和CTSS中的多态性似乎影响免疫治疗反应。患者的生殖系HLA状态也可能影响对检查点阻断的反应。HLA-A、B和C的所有位点的杂合性与一个等位基因的纯合性相比，与更好的生存结果相关，可能反映了免疫系统识别更广泛抗原谱的能力。在具有不同HLA基因变体（杂合HLA等位基因）的患者中，检查点阻断免疫治疗的成功与这些遗传变体的进化差异有关，这是通过所谓的Grantham距离来衡量的。本质上，Grantham距离有助于量化这些遗传变体随时间的进化程度。令人惊讶的是，与其等位基因进化差异较小的个体相比，具有更高进化差异的个体对检查点阻断治疗的反应更好。这一发现强调了了解我们免疫系统遗传构成的进化方面在预测免疫治疗有效性方面的重要性，为影响患者结果的一个潜在重要因素提供了见解。这在NSCLC和黑色素瘤中都有观察到。此外，特定的等位基因与黑色素瘤中的抗CTLA4治疗反应相关，HLA-B44超型与更好的预后相关，HLA-B62超型与较差的结果相关。这些结果表明，生殖系基因型可以帮助预测对免疫治疗的反应，并且是新抗原基础治疗方法的重要考虑因素。实际上，新抗原预测管道依赖于HLA等位基因的基因分型。在这一特定的癌症治疗历史时期，以免疫治疗药物的日益增加的使用为特征，了解免疫反应已成为日常挑战，这一挑战源自研究，并已无缝集成到日常临床实践中。识别和评估生物标志物，包括PD-L1状态、TMB和与微环境及基因组背景相关的其他因素，对于制定个性化治疗策略和有效分层患者至关重要。这种全面的方法对于在免疫治疗时代最大化治疗结果至关重要。此外，这种理解为癌症诊断的进步铺平了道路，包括组织和液体活检策略，最终提高了癌症护理不断发展的领域中诊断方法的精确性和有效性。近年来，基于血液的生物标志物研究取得了巨大进展，尤其是对于ctDNA。基于大量工作，现在清楚的是，ctDNA通常包含癌症患者血浆中循环无细胞DNA（cfDNA）总量的一小部分，虽然是可变的，但很小。这一部分与各种生物学因素相关，包括肿瘤类型、组织学、疾病负担、细胞增殖和基因组不稳定性。ctDNA分析的主要临床应用包括非侵入性肿瘤基因分型、治疗反应监测、治疗后微小残留病（MRD）的检测和早期癌症检测。每种应用都针对具有独特ctDNA浓度分布的独特患者群体，需要仔细考虑检测限（LOD）的要求。晚期疾病患者具有最高的ctDNA平均水平（通常>1%），允许直接从血浆中鉴定肿瘤变异，使用相对不那么敏感的LOD的检测方法。然而，在MRD检测或早期肿瘤筛查的情况下，ctDNA水平可能低于百万分之一，需要更敏感的检测方法。成为标准护理一部分的第一个ctDNA应用是非侵入性肿瘤基因分型，以识别晚期疾病患者中的治疗可行突变。越来越多地，液体活检与肿瘤组织活检同时进行，因为组合鉴定了更多的可行突变，并且液体活检具有更快的周转时间。与组织活检相比，液体活检的一个关键优势是ctDNA可以包含来自多个肿瘤沉积的贡献，因此可能比来自单一部位的组织样本更好地捕获肿瘤异质性。液体活检可以使得无法进行组织活检的患者进行肿瘤基因分型，或者当活检样本包含低肿瘤细胞性时。最初使用定量和数字PCR检测实施的ctDNA基因分型，现在主要通过NGS面板执行，该面板调查了一系列临床可行的突变。ctDNA基因分型检测对单个突变的LOD约为0.2%，适用于通常具有约1%-5%的ctDNA浓度的转移性疾病患者。在多种癌症类型的研究中，已经证明了ctDNA和组织基因分型的高一致性，并且基于血浆的基因分型被发现在大型、多中心队列中再现了预期的肿瘤突变景观。此外，前瞻性研究表明，在治疗前ctDNA分析的添加到基于组织的基因分型中可以增加在肺癌、乳腺癌和结直肠癌中治疗可行突变的检测。因此，多个专家组建议在某些晚期疾病环境中首先或与基于组织的基因分型同时进行基于液体活检的基因分型。重要的是，由于ctDNA丰度低导致的假阴性结果是血浆基础基因分型的一个关键限制，因此强烈建议在平行中或当使用液体活检首先方法未发现肿瘤突变时进行反射性组织测试，这可能会带来一些延迟。通过ctDNA的基因分型也可以在进展时使用，以识别可能的治疗可行的抗性机制。例如，在EGFR突变NSCLC患者使用酪氨酸激酶抑制剂治疗时，抗性时的ctDNA分析可以识别抗性机制，如二次EGFR突变和MET扩增。另外，TMB和微卫星不稳定性，作为免疫治疗反应的潜在预测因子，可以使用晚期疾病患者的ctDNA分析来识别。基于血液的TMB（bTMB）测量与从肿瘤组织确定的值相关，并且较高的bTMB与晚期NSCLC中对atezolizumab的更好反应相关。除了基因分型应用外，ctDNA在转移性疾病患者中的另一个潜在用途是治疗过程中监测ctDNA动态。将治疗过程中的ctDNA浓度测量作为总肿瘤负担的代理，可以用来评估治疗效果。在许多疾病和治疗背景中，治疗过程中可检测的ctDNA下降与临床效益相关。这种方法可能允许识别可能从早期治疗升级中受益的无反应者，比放射学随访更早，测试这种策略的试验正在进行中。在早期疾病患者中，ctDNA分析的两个有前景的应用是微小残留病（MRD）的检测和癌症筛查。在这两种情况下，ctDNA水平明显低于转移性疾病患者。例如，在I期肺腺癌中，治疗前ctDNA的中位浓度大约是百万分之一。同样，在以治愈为目的治疗的局部肺癌患者中，ctDNA MRD浓度可以是百万分之一或更低。这些极低的ctDNA水平需要比基于ctDNA的基因分型检测所能达到的更低的检测限（LOD）。可以通过几种策略提高ctDNA MRD检测的LOD，包括利用以往组织或血浆测序中已知的肿瘤突变（即肿瘤知情的ctDNA分析）、追踪多个突变、增加血浆输入量，以及减少在文库制备和测序过程中引入的技术假象导致的错误。最敏感的MRD方法采用个性化、肿瘤知情的方法，在这种方法中，首先对治疗前的肿瘤样本进行测序，以识别患者特定的突变，然后在治疗过程中追踪这些突变在血浆中的表达。这些检测的检测限约为0.01%，大约比上述血浆基因分型检测敏感100倍。使用肿瘤知情检测在治疗后几周内的关键时间点测量ctDNA MRD，已被证明是早期肺癌、乳腺癌和结直肠癌等的有力且早期的预后指标，通常比影像学有显著的提前时间。跨研究和肿瘤类型，治疗后ctDNA检测不到的患者比持续ctDNA阳性的患者有显著更好的结果。重要的是，尽管第一代肿瘤知情ctDNA MRD检测的阳性预测值很高，但其灵敏度并不理想。例如，第一代检测只能在约三分之一的早期NSCLC患者和一半注定复发的结肠癌患者中检测到治疗后关键时间点的MRD。这种灵敏度问题意味着，尽管第一代ctDNA MRD检测可能被用来在MRD阳性患者中加强辅助治疗，但在MRD阴性患者中不进行标准辅助治疗将导致一大部分可能受益的患者治疗不足。因此，人们非常有兴趣开发更敏感的MRD检测方法，如最近描述的PhasED-seq方法，该方法追踪相位体细胞突变，并且检测限低于百万分之一。在治愈场景中，未来的研究将需要严格测试这些更敏感的方法是否可以用来在MRD阴性患者中安全地降低治疗强度。然而，尽管这种方法在早期癌症检测中具有潜力，但在无症状个体中使用批准的筛查方式进行癌症的早期检测可以降低癌症特异性死亡率，因此，近年来对于开发基于液体活检的筛查测试非常感兴趣。然而，如上所述，早期癌症患者的ctDNA水平通常极低，通常低于百万分之一。然而，与MRD分析不同，其中可以利用先前的肿瘤突变知识来提高检测的灵敏度，筛查方法必须采用对肿瘤一无所知的方法。因此，现有的ctDNA早期检测检测无法达到与肿瘤知情的MRD检测相同的LOD，而是具有与ctDNA基因分型检测相似的LOD（约0.1%）。此外，筛查检测需要高特异性，因为大多数被筛查的个体没有癌症。因此，低特异性将导致大多数阳性检测为假阳性。即使面对这些挑战，许多商业和学术团体已经展示了ctDNA分析检测早期癌症的潜力。这些研究采用了各种技术方法，包括分析体细胞突变、cfDNA甲基化、cfDNA片段化模式以及多种方法的组合。尽管有希望，基于ctDNA的早期检测方法仍然存在重要的缺点。一个反复出现的问题是，检测的性能在最初报告它们的研究中往往过于乐观，在随后的验证研究中会降低。此外，鉴于目前通过对肿瘤一无所知的方法可以实现的相对较差的LOD，早期癌症的灵敏度仍然不够理想。例如，基于DNA甲基化的、临床上可用的Grail Galleri测试，对于I期肺腺癌的灵敏度仅为7%。因此，仍然迫切需要进一步的技术进步，以提高对肿瘤一无所知的ctDNA检测的灵敏度。最终，大型、随机的研究将需要确定基于液体活检的早期检测是否能够实现癌症特异性死亡率的益处。尽管近年来许多癌症生物标志物工作集中在ctDNA上，但检测肿瘤衍生的循环RNA和新型基于蛋白质的技术是另外两种有望发展为临床有用生物标志物的方法。尽管早期的无细胞RNA（cfRNA）研究主要关注小microRNA作为潜在的癌症生物标志物，但最近的一些研究报告了概念验证数据，证明信使RNA（mRNA）也可以在健康对照组和癌症患者的血浆中被检测到。这些研究开始揭示cfRNA的细胞起源，发现尽管大部分cfRNA来自造血细胞，但实体组织也向血浆贡献cfRNA。最近一项比较肺癌或乳腺癌患者与健康对照组cfRNA的研究发现，血浆转录组反映了肿瘤的起源组织，表明cfRNA可能在检测、诊断和监测恶性肿瘤方面具有应用价值。血浆蛋白作为癌症生物标志物有着悠久的历史，并且通常在临床环境中使用。然而，下一代蛋白质检测在液体活检检测开发方面落后于核酸的NGS。尽管质谱仍然是分析蛋白质组的主要工具，但它对于低丰度蛋白质的灵敏度不足，这些蛋白质通常包括需要测量的关键癌症相关蛋白质。最近在靶向多重蛋白质检测检测方面的突破促进了对数千种蛋白质的查询，提高了对低丰度蛋白质的灵敏度。两种特别有希望用于液体活检应用的检测方法是：Olink Proteomics的邻近延伸检测（PEA）和SOMAlogic的慢离率修饰配体检测（SOMAscan）。使用邻近连接或基于DNA的配体来捕获感兴趣的蛋白质靶标，这两种检测方法都可以从小生物液体样本中测量数千种不同丰度的蛋白质。最近的研究已经证明了这些技术揭示癌症相关蛋白质组信号的能力。与ctDNA相比，液体活检蛋白质组学和转录组学处于开发的早期阶段，但最近的进展表明，这些分析物在未来的领域中也可能发挥更突出的作用。癌症研究的一个关键目标一直是将液体活检用于日常临床实践。特别是，ctDNA分析已经改变了癌症诊断。与传统的组织活检一起进行的液体活检，提供了诸如捕获肿瘤异质性、监测治疗反应、检测微小残留疾病MRD和早期癌症检测等优势。除了ctDNA，涉及循环RNA和先进蛋白质检测的新兴方法具有潜力，需要进一步的创新和大规模研究来确定临床效用和对癌症特异性死亡率的影响。在快速发展的癌症治疗领域，生物标志物越来越被视为推动精准医学的核心，标志着肿瘤学中的一个转型阶段。生物标志物的诊断能力，如ctDNA和免疫分型，对个性化癌症治疗策略至关重要。特别是ctDNA，将通过实现对遗传突变的精确识别，从而允许治疗个性化，提高疗效并最小化副作用，从而彻底改变癌症治疗。在治疗协议中采用ctDNA标志着向一种策略的转变，在这种策略中，生物标志物不仅有助于诊断，还指导治疗选择，监测残留疾病，并跟踪癌症的演变和对治疗抗性的异质性。将免疫分型生物标志物与癌症治疗的整合引入了治疗方式的细微层次，利用免疫系统与治疗剂之间复杂的相互作用来改善治疗结果。这种方法强调了为新治疗策略的有效性精确选择患者的重要性，以及开发协同作用更强的治疗的必要性。预测性生物标志物作为优化治疗策略的重要工具，确保治疗不仅有效，而且专门针对个体患者的分子特征，从而最大化效益并最小化风险。这对于精准肿瘤学的进展至关重要。此外，围绕ADCs的生物标志物不可知策略的叙述表明了一个复杂的范式。这种策略认识到某些ADCs可能不需要特定的生物标志物就能发挥效用，扩大了它们的适用性，但也突出了进一步发现生物标志物以增强它们的活性和可及性的必要性。最后，将生殖系基因组学作为预测性生物标志物整合的潜力为个性化癌症治疗开辟了新的途径，根据遗传洞察进一步完善治疗决策。这种向整合生殖系和体细胞生物标志物（如ctDNA）的演变，标志着癌症治疗中的策略转变，丰富了我们对癌症进展、异质性和治疗抗性的理解。总之，生物标志物在癌症治疗中的未来充满希望，将其功能从单纯的诊断工具提升为个性化治疗范式的不可或缺的协调者。导航这个未来需要对基于生物标志物和生物标志物不可知策略的复杂动态有微妙的把握，强调需要非常专业化和严格应用的肿瘤学护理。同时，它呼吁政治、学术和工业界立即进行并得到良好支持的对话，以改善全球对分子生物标志物的获取。通过政策制定者、研究人员和行业参与者之间的协作努力，我们可以动员资源克服获取障碍和差异。这一全面愿景不仅满足了有效癌症护理的即时要求，而且为个性化治疗的持续进步奠定了基础。最终，这一集体努力有望转变癌症治疗，确保全球患者获得积极结果。这一全面愿景为所有癌症患者更有效和个性化的治疗铺平了道路，标志着抗癌斗争的新时代。
