神经示踪是研究神经环路形态和功能的常用方法，而利用病毒导入荧光蛋白是一种高效的示踪方式。鼠来宝生物精选并翻译一篇相关综述，供读者参考。
Qiu, L., Zhang, B. & Gao, Z. Lighting Up Neural Circuits by Viral Tracing. Neurosci. Bull. 38, 1383–1396 (2022). https://doi.org/10.1007/s12264-022-00860-7
通过病毒示踪点亮神经回路
神经元高度交织形成复杂的神经回路，这些回路是大脑处理信息、产生思想和指导行为的基础。解剖神经回路的组织结构是解读大脑如何加工信息、执行指令以产生思想和引导多样行为的关键。在过去的几十年中，重组病毒载体已成为定义回路架构最常用的示踪工具。在这篇综述中，我们介绍了当前的病毒工具类别及其在回路示踪中的适当应用。我们进一步讨论了病毒示踪策略的一些进展，以及未来研究中病毒工具的潜在创新。
引言
人脑由近860亿个高度交织的神经元组成，是指导多种生理功能和行为的最复杂和最精密的器官。每个神经元通过突触与其他数万个神经元接触或被接触，神经元通过这种方式将信息从一个传递到另一个。这些神经元相互连接构成复杂的功能网络，即神经回路，以精确地在大脑中传递和处理信息。解开这些回路的复杂组织对于解读信息是如何被处理的，以及执行指令是如何产生思想和引导多样行为至关重要。已经开发出许多技术来定义神经回路的架构。自1971年首次使用辣根过氧化物酶作为逆向示踪剂以来，已经过去了五十年[1, 2]。在过去的半个世纪中，开发了许多新的化学示踪剂，例如顺向示踪剂菜豆素-凝集素[3]和地克司蓝胺[4]，以及逆向示踪剂氟金[5]和霍乱毒素B亚单位[6]，这些都有助于表征神经回路的整体架构。然而，使用这些化学示踪剂的标记策略通常是短暂的，没有细胞类型特异性。近年来，病毒示踪剂的发展迅速推进了神经回路的解剖。自1974年首次在神经解剖示踪中使用单纯疱疹病毒(HSV)[7]以来，经过基因改造的病毒载体已成为神经回路绘图中最常用的工具，因为它们具有降低的细胞毒性、长期表达报告基因、有效的轴突运输或跨突触运输、细胞类型特异性接入和在遗传改造背景下的时空转导。结合Cre/Flp介导的重组策略，含有荧光蛋白表达盒的病毒可以选择性地示踪神经元体、它们的投射和它们突触连接的神经元，从而点亮大脑中的神经回路。常规用于神经示踪的病毒在嗜性、轴突或跨突触运输和转基因表达方面各不相同（表1）。因此，了解不同病毒的特性以选择不同目的的正确工具非常重要。在这篇综述中，我们介绍了常用病毒载体的关键特征及其适当的应用，以及在开发先进病毒示踪剂方面的最新进展和前景，以满足更多的需求和解决复杂问题。
病毒在神经示踪中的工具
一个世纪前，人们遭受了一种以口腔和生殖器区域水疱为特征的疾病。直到1923年HSVs的发现，这种病的元凶才为人所知[8]。HSVs感染皮肤上皮细胞，通过感觉神经传播，最终到达中枢神经系统中的神经元细胞体[9]。这些发现激发了科学家在1980年代测试将HSVs应用于回路示踪的可能性[10, 11]。自那时以来，已经鉴定出更多类型的病毒，并且在实验室中进一步对其基因组进行了遗传改造，以产生重组病毒。这些病毒已广泛用于神经示踪，并促进了神经回路的解剖。几种类型的病毒示踪剂通常被使用，包括HSV、腺相关病毒(AAV)[12]、犬类腺病毒-2(CAV-2)[13]、狂犬病病毒(RV)[14]、假狂犬病病毒(PRV)[15]。一般来说，根据它们跨越突触的能力，病毒示踪剂可以分为两类：非跨突触和跨突触。非跨突触病毒不能跨越突触到达其他神经元，仅限于感染的神经元，而后一类可以跨越突触并传播到其他突触连接的神经元。这两类都包含沿轴突顺向或逆向运输的病毒。关于病毒的不同特性和应用的详细信息已经被广泛回顾[16–20]。在这里，我们总结了神经示踪中广泛使用病毒的特征（图1）。
图1. 不同病毒示踪策略的图解
病毒示踪策略可以根据它们跨越突触的能力分为三类：非跨突触（上图）、单突触（中图）和多突触（下图）。每一类都包含顺向（左图）和逆向（右图）方法，这取决于病毒的运输方向。在顺向示踪中，病毒通常被注入到细胞体区域（注射区），感染细胞体并通过荧光蛋白的表达完全标记轴突末端，从而追踪末端区域（投射区）。非跨突触病毒不能跨越突触（上图左），而单突触或多突触病毒可以转移到跨越一个（中图左）或多个突触（下图左）的下游神经元。在非跨突触逆向示踪中，病毒通常被注入到末端区域，它们在那里感染轴突末端并向细胞体逆向传播（上图右）。在单突触或多突触逆向示踪中，病毒被注入到突触后神经元区域，被转移到突触前末端，并向细胞体逆向传播（中图右），或进一步向上游突触连接的神经元传播（下图右）。同时表达绿色和红色荧光的神经元表示GFP和mCherry的共表达，而蓝色神经元则未被病毒感染（后续图表中使用相同的惯例）。黑色箭头指示病毒颗粒的传播方向。AAV，腺相关病毒；AAV1，AAV的一个亚型；AAVrg，AAV的逆向示踪变体；CAV，犬类腺病毒；hSyn，人类突触蛋白I；TK，胸苷激酶；HSV，单纯疱疹病毒；H129-ΔTK，删除了TK基因的HSV顺向示踪重组体；G，狂犬病糖蛋白；RVΔG，删除了G基因的狂犬病病毒；EnvA，禽类ASLV类型A的包膜蛋白；TVA，EnvA的禽类受体；PRV152，假狂犬病病毒的逆向示踪重组体。
非跨突触示踪病毒
如上所述，非跨突触病毒不能跨越突触，仅限于局部感染的神经元。根据病毒沿轴突的运输方向，非跨突触病毒进一步细分为顺向和逆向病毒。顺向病毒通常感染神经元细胞体，病毒转基因产物如荧光蛋白通过病毒颗粒的顺向运输或沿轴突过程的被动扩散被运输到轴突末端，而逆向病毒通常感染神经末梢并从末端运输到细胞体。非跨突触顺向示踪需要病毒感染神经元细胞体，并通过病毒颗粒的顺向运输或其沿轴突过程的被动扩散完全标记它们的轴突末端。有了病毒的报告基因表达和随后的荧光蛋白在神经元细胞体和过程中的填充，顺向示踪能够确定某个神经途径的输出并描绘神经元形态。虽然许多类型的病毒满足这一需求，但AAV是最广泛使用的顺向示踪工具[21]。AAV是非包膜单链DNA病毒，基因有效载荷容量限制在*4.7 kb。几个优势使AAV成为神经示踪中最受欢迎的工具。首先，AAV不能自我复制，因此它们的表达通常限于注射的神经元。其次，AAV很少整合到宿主基因组中，它们的免疫原性很低，罕见的免疫反应或毒性[22]。第三，AAV中的转基因在几个月内稳定持久地表达[23]。AAV有多种血清型，定义为具有不同抗原性的病毒衣壳。不同的AAV血清型结合不同细胞群体表达的不同受体，导致物种、组织和细胞特异性嗜性[24]。最常用的重组AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV8和AAV9[25]。由于AAV2的扩散有限，它对神经元具有高度选择性[26]，因此目前使用的重组AAV(rAAV)载体基于AAV2的框架。rAAV是通过将AAV2的两个反向末端重复序列的基因感兴趣基因夹在中间与其它血清型的衣壳包装而成[27]，如AAV8或AAV9，以制造杂交AAV2/8或AAV2/9。这些工程化的rAAV结合了不同血清型的优势，并满足了研究中需要不同程度病毒扩散的不同需求。不同的AAV血清型具有不同的细胞嗜性。例如，AAV5似乎在大鼠皮层细胞原代培养中表现出胶质细胞嗜性[28]，而其他血清型对神经元更具选择性。然而，血清型不是体内细胞类型特异性感染的主要决定因素，因为大脑区域和病毒的给药方式也影响嗜性。因此，AAV需要特定的启动子来在特定细胞类型中表达转基因。例如，hSyn（人类突触蛋白I）通常用作全神经元启动子，gfaABC1D作为星形胶质细胞特异性启动子[29]。选择性靶向特定细胞类型最常见的方法是通过Cre-LoxP（P1位点的交叉点）和Flp-FRT（Flp重组靶位点）系统基于遗传的方法，其中转基因表达在Cre或Flp重组酶存在时被允许[30, 31]。当研究大脑某个区域在神经回路中的功能时，确定上游输入的来源是不可或缺的，这可以通过逆向示踪来实现。逆向示踪基于病毒从轴突末端进入和病毒颗粒向神经元细胞体的逆向运输。与顺向示踪相反，逆向示踪需要病毒与轴突末端表达的表面受体结合。几种类型的病毒表现出末端进入和逆向扩散的特性，包括CAV-2、RV、PRV和一些特定株系的HSV。在这些病毒中，只有CAV-2不能跨越突触传播，而后三种可以（见下文）。CAV-2是一种双链DNA腺病毒，具有许多优点，如免疫原性低、相对较大的基因有效载荷高达30 kb、对神经元高度选择性、持久的基因表达和高效的逆向运输[13, 32, 33]。然而，限制其应用的缺点是细胞嗜性。CAV-2的结合和内吞作用需要柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR），它主要定位于突触前末端，并介导病毒进入和逆向运输[34, 35]。换句话说，CAV-2专门感染表达CAR的轴突末端。因此，使用CAV-2进行的逆向示踪可能无法标记CAR表达低或不表达的神经元。尽管RV天然表现出跨突触运输的特性，并且最常用于逆向单突触示踪（见下文），但最近工程化的RV缺失糖蛋白（G）的SADDG-EGFP也是非跨突触逆向示踪的极好工具（图2A）。在这个RV中，编码糖蛋白的基因被编码增强绿色荧光蛋白（EGFP）的基因所取代[36]。由于包膜糖蛋白对于RV跨突触传播至关重要，重组RV失去了传播到其他突触连接的神经元的能力，仅限于最初感染的细胞（图2B）。然而，由于重组病毒保留了复制的能力，扩增的病毒有助于增强荧光信号，使其适合于描绘逆向标记的神经元形态。
图2. 伪型狂犬病病毒用于逆向示踪
A. 通过删除糖蛋白和EnvA伪型化工程化狂犬病病毒（RV）。正常的RV（左侧）包含一个由五个基因组成的负义RNA基因组和一个被糖蛋白（G）包被的包膜，G是由五个基因之一编码的。通过用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）替换G基因，并将这种缺失G的RV与EnvA（一种禽类病毒的包膜蛋白）伪型化，可以对RV进行工程化改造（中间和右侧）。
B. 使用SADΔG-EGFP进行非跨突触逆向示踪。重组的RV SADΔG-EGFP中，编码G的基因被删除，虽然被G包被，但失去了产生G的能力。这种病毒可以感染轴突末端（由没有红色交叉的黑色箭头显示），并向细胞体逆向传播。它保留了复制和产生大量病毒的能力，从而增强了EGFP荧光信号。然而，由于无法合成G，新产生的后代无法传播到突触连接的神经元（由带有红色交叉的绿色箭头显示）。
C. 使用EnvA伪型的RV进行单突触逆向示踪。由于哺乳动物大脑中的神经元缺乏EnvA的内源性受体，EnvA-RVΔG无法感染神经元（由带有红色交叉的黑色箭头显示）。当EnvA受体TVA通过Cre依赖性（DIO）AAV辅助载体在Cre+神经元中异源表达时，EnvA-RVΔG可以有选择性地感染含有TVA的细胞（绿色加红色的神经元），如没有红色交叉的黑色箭头所示。在同一细胞中补充G后，新生成的病毒RVΔG+G恢复了跨突触传播的能力（由绿色箭头显示），传播到突触前神经元（绿色）。然而，由于这些突触前神经元中缺乏G表达，病毒无法进一步从这些细胞中传播出去（蓝色）。红色交叉表示无法进行。ns，负义链；N，核蛋白；P，磷酸蛋白；M，基质蛋白；G，糖蛋白；L，狂犬病病毒的聚合酶；DIO，双重翻转开放阅读框；SADΔG，一个缺失G的RV株系。非跨突触逆向示踪的另一个强大工具是rAAV2-retro，这是一种最近开发的AAV变体，显示出比其他AAV血清型和CAV-2更高的逆向运输效率[37]。这个变体包含一个通过易错PCR产生的突变衣壳，经过几轮筛选后显示出最高的逆向运输能力。rAAV2-retro具有高效的逆向运输性，转基因表达稳定，并已成为解剖特定神经途径的最常用的逆向病毒示踪剂。最近，通过将这种强大的病毒示踪剂注入后垂体（PPi），我们成功标记了向后垂体投射的神经内分泌细胞群，并重建了下丘脑-神经垂体系统的三维结构[38]。除了rAAV2-retro，还开发了其他具有高逆向运输效率的工程化AAV，包括AAV MNM008[39]、AAV2 R585/R588[40]和AAV-TT[41]。在这些病毒中，AAV MNM008似乎表现出对多巴胺能神经元的改进的逆向感染性[39]。携带荧光蛋白表达盒的能力，以及高效的逆向运输和低毒性的特性，使rAAV2-retro成为现代神经科学研究中逆向示踪的理想工具。
跨突触示踪病毒
跨突触示踪病毒能够跨越突触，传播到神经回路中的其他神经元，这主要归功于它们自身的复制能力。根据它们在突触前和突触后神经元之间的传播方向，跨突触病毒也分为顺向（从突触前到突触后神经元）和逆向（从突触后到突触前神经元）病毒。神经元通过突触复杂地相互连接，构成了一个复杂的层级网络。为了完全理解神经回路的结构，有必要解剖突触途径的解剖组织。尽管AAV是描绘神经元形态和投射区域的绝佳工具，但它们并不揭示不同区域中神经元之间的突触连接。它们也不提供有关下游神经的分子身份的信息。因此，需要顺向跨突触病毒示踪剂来解决这些问题。几种类型的病毒由于在最初感染的神经元中的自我复制以及向下游神经元的传播，而自然表现出跨突触转导。其中之一是HSV，一种带有包膜的双链DNA病毒，与其他病毒相比，具有相当大的有效载荷容量，基因有效载荷*30-40 kb。HSV有许多株系，表现出不同的顺向和逆向跨突触运输特性以及不同的细胞毒性[42, 43]。HSV-1的H129株已被广泛用于顺向多突触神经示踪[44]，特别是在定义某些大脑区域的外周传入或传出途径的研究中[45]。然而，由于H129是一种具有复制能力的病毒，它能够持续地跨越多个突触层次传播。这导致在大脑中无法控制的感染，可能加剧细胞毒性，最终导致动物死亡。此外，很难区分具有单突触和多突触连接的神经元。另一个限制是，原生HSV不能选择性地标记特定的神经元群体，但最近通过工程化HSV基因组已经解决了这个问题。在工程化病毒中，需要病毒复制的胸苷激酶（TK）基因被一个包括loxP-STOP-loxP的盒式结构以及下游的tdTomato和一个密码子修饰的TK基因所取代[46]。这种重组HSV，即H129DTK-TT，无法表达TK基因，在缺乏Cre重组酶的情况下失去了复制和跨突触传播的能力。该病毒只有在含有Cre的神经元及其突触后神经元中恢复复制能力并驱动报告基因的表达，因此，结合基于Cre的遗传动物品系，它是顺向示踪的良好工具。另一种重组H129（H129-DTK-tdT）是通过将病毒TK基因替换为由巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的tdTomato基因而产生的，以允许报告基因的表达，但破坏了复制和跨突触传播的能力[47]。当在H129DTK-tdT感染的细胞中存在携带TK盒的AAV辅助载体时，H129-DTK-tdT恢复了复制能力并转导了突触后神经元。然而，由于第二级神经元中缺乏TK表达，H129-DTK-tdT不能继续传播到下游神经元，使顺向示踪严格限定为单突触。结合Cre依赖的AAV辅助物，这种H129-DTK病毒已成功用于鉴定直接由腹侧CA1的Htr2c神经元支配的Edinger-Westphal核中的神经元群体[48]。尽管HSV1是顺向跨突触示踪的强大工具，但其高毒性限制了其在长期功能性解剖特定神经连接中的应用。此外，HSV也被轴突末端摄取，并表现出延迟的逆向运输[46]。最近，一种针对黄热病的活减毒疫苗（YFV）YFV-17D已被工程化用于顺向跨突触示踪，具有低细胞毒性[49]。这种YFV-17D包含三个编码结构蛋白的基因（C、prM和E）和五个对病毒复制至关重要的基因（NS1-NS5）。通过删除NS1基因，YFVDNS1失去了复制的能力。在起始神经元和突触后神经元中补充NS1后，YFVDNS1恢复了跨突触传播的能力并标记了突触后神经元。然而，与HSV类似，YFV病毒也表现出延迟的逆向运输。为了限制其逆向运输，作者使用了可诱导的Tet-ON策略，通过间歇性的多西环素诱导来限制NS1的补充，以最小化病毒复制，从而减少逆向运输和细胞毒性。此外，通过删除结构蛋白编码基因（C、prM和E），新变体YFVDCME无法自我包装，从而失去了感染神经元的能力。YFVDCME病毒在起始细胞中恢复了包装能力，当提供结构蛋白时，具有传播到突触后神经元的能力。然而，由于下游神经元中缺乏结构蛋白，病毒未能进一步转移，从而实现了单突触顺向示踪。此外，由于YFVDCME变体包含完整的NS1基因，因此无需在下游区域补充NS1。这种YFVDCME变体可用于映射特定神经元细胞类型的全单突触投射（projectome）[49]。另一个有效的单突触顺向示踪剂是AAV1载体，最近发现它在高滴度下表现出顺向跨神经元传播[50]。AAV9也表现出类似的特性，尽管比AAV1的滴度更高。其他AAV血清型，如AAV5、AAV6和AAV8，尚未显示出此类特性。值得注意的是，与HSV相比，AAV1介导的跨突触示踪的效率相对较低。因此，这种策略需要应用Cre或Flp重组酶来放大下游报告基因的表达，从而更清晰地识别和更有效地操纵突触后神经途径。另一个问题是，AAV1也可以逆向标记突触前神经元（尽管效率较低）[50-52]，这可能会混淆突触后神经元的识别。逆向跨突触示踪在现代神经科学研究中已经得到了很好的建立和广泛的使用，这得益于PRV和伪型RV的发展。值得注意的是，PRV不是狂犬病病毒。与HSV类似，它属于疱疹病毒科。它是一种带有包膜的双链DNA病毒，具有较大的基因包有效载荷。不同株的PRV运输方向不同。野生型的有毒株，即PRV-Becker，能够在连接的神经元之间双向（顺向和逆向）传播，而另一种减毒株PRV-Bartha则表现出选择性的逆向运输[53]。PRV-152是通过对PRV-Bartha的工程化，通过在病毒基因组中添加CMV-EGFP盒来允许GFP表达，广泛用于逆向多突触示踪[54, 55]。需要注意的是，PRV具有高度的毒性和致命性，通常在脑内注射后3-4天内导致动物死亡[56]。尽管PRV-Bartha是一个减毒株，它只延长了动物的寿命几天[54]。因此，研究人员在使用PRV时应小心，并采取安全预防措施。由于多突触运输的特性，PRV是短期逆向示踪终止于外周的多级神经回路的优秀工具。然而，与HSV类似，由于其无法控制的跨突触传播，很难区分PRV标记的神经元是单突触还是多突触连接。另一种强大的载体，工程化的RV，出现是为了克服这个限制[57]。RV是一种带有包膜的负义单链RNA基因组的病毒，由五个基因组成[14]。在五个基因中，一个编码狂犬病糖蛋白（RG），即介导RV进入细胞的包膜蛋白。实际上，野生型RV可以跨越多个突触层次传播[58]；然而，与HSV不同，它自然表现出仅逆向运输而不引起细胞病变或泄漏到局部胶质细胞[58, 59]。通过用荧光报告基因替换RV的天然G基因并对这种G缺失的RV进行EnvA（EnvARVΔG）伪型化，实现了逆向单突触示踪。这种伪型的EnvA-RVΔG失去了感染哺乳动物细胞和转移到突触连接的神经元的能力。当哺乳动物细胞表达外源性肿瘤病毒受体A（TVA），即EnvA的相应禽类受体时，EnvA-RVΔG能够选择性地进入神经元。然而，除非外源性补充糖蛋白，否则它无法突触转移。因此，通过在选定的细胞亚群中以Cre依赖的方式表达TVA和G的辅助AAV，EnvA伪型的RVΔG能够感染TVA携带的细胞，也称为起始细胞。此外，由于这些细胞中G的补充，RVΔG恢复了向直接支配起始细胞的上游神经元的跨突触传播能力。一旦病毒到达上游（突触前）神经元，由于缺乏G，它就无法进一步传播到第二级突触前神经元，从而实现了单突触逆向示踪[60]。
病毒示踪的进展和前景
重组神经嗜性病毒已经成为现代神经科学研究中最强大和最常用的工具，无论是在神经元形态描绘还是神经回路示踪方面。自从它们最初被发现和应用以来，每种类型的病毒在过去几十年中都经历了快速发展，取得了许多惊人的进展。在接下来的部分，我们将介绍当前重组病毒在神经回路示踪中的一些尖端应用。在如此多的病毒类型中，AAV是最常用的用于宿主中转基因传递的工具。它能够标记局部的细胞体和远端的轴突末端，这表明了某些神经元群体的下游投射。此外，通过表达荧光报告基因，AAV能够描绘神经元的形态，包括细胞体、树突和轴突末端。然而，一些神经元向下游区域投射，形成长的轴突束。由于常用AAV沿长轴突的荧光信号强度低且不均匀，无法提供轴突投射路径的完整视图。此外，由于AAV在局部注射部位的感染效率高，很难区分单个神经元的形态。最近开发的双AAV系统克服了这一限制，并以细胞类型特异性的方式实现了单个神经元的稀疏和明亮标记[61]。该系统包括一个包含四环素响应元素（TRE）启动子驱动的、Cre依赖的、Flp表达盒的“控制器”AAV载体；以及一个包含TRE启动子后跟Flp依赖的GFP-IRES-tTA盒的“放大器”载体。由于TRE有些泄漏[62]，它能够在没有四环素转录激活因子（tTA）的情况下，低水平地驱动下游基因盒的表达。当“控制器”和“放大器”载体在Cre表达的小鼠品系中共同注射到大脑时，由控制器驱动的TREA驱动的Flp表达（来自控制器）只会在少数Cre表达的神经元中随机发生。正是在这些神经元中，Flp驱动放大器中基因盒的重组，导致由于TRE的泄漏而产生最低水平的tTA蛋白表达。tTA随后结合到TRE启动子上，并进一步增强Flp和tTA的表达。这一级联反应形成了一个正反馈回路，以增强只有少数神经元中的GFP表达，从而实现单个神经元的稀疏但明亮的标记（图3）。标记效率的程度可以通过调整控制器载体的滴度来调节。结合荧光微光学切片断层扫描技术，这是一种全脑重建技术[63]，这种稀疏标记使得可以完全展示细胞类型特异性单个神经元的形态，包括它们长的轴突树突。
图3. 用于稀疏标记细胞类型特异性神经元的双AAV系统。双AAV系统的设计图解，用于稀疏标记，包括一个“控制器”和一个“放大器”AAV载体（左上角）。当这两种载体混合并注入表达Cre的小鼠时，四环素响应元件（TRE）的泄漏驱动了少数Cre阳性神经元中Flp（翻转酶）的弱表达。随后，Flp翻转放大器中的GFP-IRES-tTA盒，并在这些稀疏标记的神经元中驱动GFP（绿色荧光蛋白）和tTA（四环素转录激活因子）的低水平表达（右面板）。少量的tTA进一步结合到TRE上，增强了Flp和GFP的表达（中下方），从而触发正反馈以增强稀疏神经元中GFP的表达（左下方）。TRE，四环素响应元件；Flp，翻转酶；IRES，内部核糖体进入位点；tTA，四环素转录激活因子。逆向示踪剂CAV-2通常与其他载体结合使用，以实现特定投射的示踪。例如，一个包含Cre依赖性基因盒（例如荧光报告基因）的AAV载体被注入候选的源头区域，而携带Cre重组酶的CAV-2被注入假定的下游区域。当逆向运输的CAV-2到达神经元细胞体时，Cre重组酶驱动报告基因的表达，从而选择性地标记投射到下游区域的神经元[64]。然而，CAV-2的应用受到神经系统中CAR表达限制的限制。最近的一项研究通过在候选投射神经元中表达CAR的受体补充策略克服了这一限制[65]。这导致CAV-2的逆向标记效率显著提高。此外，通过设计Cre依赖的CAR缺失（CreOFF）以及同时表达荧光报告基因或光敏蛋白（Cre-ON），这种策略不仅从逆向标记的神经元中去除了CAR以避免潜在的对正常神经元功能的干扰，而且还提供了一种结构和功能上表征神经回路的方法。EnvA包被的RVΔG系统被广泛使用，不仅用于追踪特定神经元群体的单突触输入[66, 67]，还与表达如光敏蛋白和仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）等元素的其他病毒工具结合使用，以操纵神经回路[68]。最近，开发了结合了CAV-2和RVΔG应用的巧妙示踪策略，称为TRIO（追踪输入和输出之间的关系）和cTRIO（细胞类型特异性TRIO），它们能够实现三节点（例如A-B-C）电路示踪[69]（图4）。在TRIO中，携带Cre依赖的TVA受体和RG的AAV辅助载体被传递到区域B，而表达Cre重组酶的CAV-2被注入下游区域C。CAV2-Cre病毒逆向传播到区域B，并在投射到区域C的神经元中仅驱动TVA和RG的表达。然后允许EnvA伪型的RVΔG感染这些投射特异性的神经元，并通过跨突触运输到上游区域A的突触前神经元。在cTRIO中，这种三节点示踪方法已应用于转基因小鼠，并能够识别区域B中特定细胞类型在区域A的输入和输出。具体来说，注入区域B的AAV辅助物被Flp依赖的TVA和RG所取代，而以Cre依赖的方式表达Flp重组酶的CAV-2被传递到下游区域C。通过这种方式，在区域B中，只有在区域C有神经支配并且含有Cre的神经元才能表达TVA和RG，允许随后通过RVΔG介导的跨突触标记区域A中的神经元。
图4. TRIO和cTRIO的病毒策略。TRIO结合了CAV-2和RV的应用，从而允许在三节点神经回路中进行特定投射的逆向示踪（从区域A通过B到C）。cTRIO进一步结合了遗传方法，允许绘制细胞类型和特定投射的神经回路（从区域A通过B中的Cre阳性细胞到C）。TRIO，追踪输入和输出之间的关系；cTRIO，细胞类型特异性的TRIO；DIO，双重翻转开放阅读框；fDIO，受Flp控制的DIO。
尽管这种交叉策略现在通常用于多级神经元之间的电路绘图，但它仍然有一些限制[70]。首先，广泛使用的RV株SAD-B19是一种减毒株，突触传递效率相对较低[71]。其次，尽管减毒株的细胞毒性降低，但RV感染会在1-2周内导致细胞死亡，从而阻碍了其在长期功能操纵神经网络中的应用。幸运的是，最近的研究已经产生了一种新的G缺失RV株（CVS-N2CDG），它具有增强的跨突触传递和降低的细胞毒性，部分克服了这两个限制[72, 73]。另一项研究还开发了一种自灭活RVΔG（SiR），它通过蛋白酶体降解破坏病毒的转录-复制周期，在最初感染的细胞中关闭。由于SiR也携带Cre元素，它允许永久性地获得追踪的细胞的遗传途径，但防止了神经元毒性[74]。
虽然当前的病毒工具在不同方面仍有限制，但病毒与不同遗传策略的组合使用将扩大其应用范围。如上所述，工程化病毒可以以细胞类型特异性和投射特异性的方式标记感兴趣的神经回路，结合不同的重组酶系统。然而，基于一个标记基因来定义和访问功能特异性的神经元子集是不够的，因为神经元具有数百个亚类。使用多路重组酶系统的交叉策略允许病毒以遗传和功能上更具体的方式获得对更特定细胞亚型[75]的访问。在最近的一项研究中，Cre和Flp依赖的病毒被传递到一个双转基因小鼠中，其中Tac1阳性神经元表达Cre，GABA能神经元表达Flp，从而特别标记和操纵Vgat和Tac1双阳性神经元[76]。另一项研究使用由细胞亚类特异性增强子驱动的重组酶表达病毒，在新的三色报告小鼠Ai213中，允许在小鼠皮层中特定和同时标记三个不同的细胞亚群[77]。未来，借助多功能重组酶和病毒系统，我们可能能够基于输入和投射标记策略（图5）标记更特定的神经元子集（图5中的区域B）。例如，在区域B中有两种不同的细胞群体（Cre阳性和Cre阴性）。通过在B的假定下游区域（区域C）注入CAV2-DIO-Flp，投射到C的Cre阳性细胞表达Flp重组酶。然而，这特定群体的细胞通常由多个上游输入所支配。在注入携带GAL4的顺向跨突触AAV1载体到突触前区域（A）后，被区域A支配的神经元（在B中）表达GAL4。通过进一步在局部区域（B）注入UAS（上游激活序列）驱动的AAV载体表达Flp依赖的GFP，我们能够特别标记由区域A支配但投射到C的Cre阳性细胞（如图5所示）。通过这种方式，可以通过其特定的输入、输出和分子身份来遗传访问更具特异性的神经元子集。
图5. 交叉策略用于定义和访问更具体的细胞类型。
通过结合多重重组酶系统，包括GAL4-UAS、Cre-LoxP和Flp-FRT，可以根据它们的输入、输出和分子身份定义出更特定的神经元子集。图解显示，表达Cre并投射到区域C的神经元含有Flp。然而，只有接收来自区域A（以绿色显示）输入的神经元才能表达GAL4，GAL4结合到UAS启动子并启动注入到区域B的病毒的下游表达。在这种情况下，可以访问到一种特定的细胞类型，该细胞类型表达Cre，由某些输入支配，并且投射到假定的下游目标。目前，病毒示踪剂大多是通过侵入性的开颅手术或注射到外周组织来递送的。对于交叉标记策略，需要将几种不同类型的病毒注射到不同的目标区域，这不可避免地会导致损伤或创伤。系统性递送，主要是通过静脉注射，为病毒递送到中枢和外周神经系统提供了一种更简单、非侵入性的替代方法[78, 79]。新开发的AAV变体AAV.CAP-B10在静脉注射后显示出对大脑神经元的高特异性和高效性，且在肝脏中的积累很少[80]。虽然静脉注射更常用于基因治疗，但可以合理推测系统性递送也可用于病毒示踪来接触特定细胞类型。例如，通过局部应用聚焦超声波打开血脑屏障，系统性递送的病毒能够进入这一目标区域[81]。此外，将细胞类型特异性启动子添加到病毒基因组中，使用重组酶系统，或根据细胞和组织的嗜性设计病毒衣壳，也有助于实现系统性递送病毒的细胞类型特异性进入。
结论
工程化病毒已经成为现代神经科学技术库中最强大的工具。理想的病毒工具应当是无毒的，具有更大的转基因包装能力，更容易和非侵入性的递送方式，以及对目标细胞具有更高的特异性，但在物种间的适用性更广[82]。除了传统修改病毒基因组和衣壳/包膜外，新方法，包括M-CREATE（基于多重Cre重组的AAV靶向进化）[83]和机器学习引导的设计[84]，已经被开发出来，用于筛选和工程化具有更广泛适用性的新重组病毒。随着病毒未知机制的逐渐揭示，我们相信在不久的将来会开发出更合适的病毒工具，并加速神经科学的进步。
