光遗传学

Karl Deisseroth

2024-05-07

光遗传学是如今进行神经操控的重要技术手段，鼠来宝生物精选并翻译了“光遗传学之父” Karl Deisseroth的一篇相关综述，供读者参考。

Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nat Neurosci 18, 1213–1225 (2015). https://doi.org/10.1038/nn.4091

光遗传学：神经科学中微生物视蛋白的十年

摘要

在过去的十年中（2005-2015年），微生物视蛋白工程、模块化遗传方法的细胞类型靶向以及引导光线穿过组织的光学策略的发展和融合，使得在活体系统中对特定细胞进行多功能的光学控制成为可能，这定义了现代光遗传学。尽管对细胞信号传递的空间和时间精确的因果控制的重要性有着广泛的认可，但在这十年的前半段（2005-2009年），当光遗传学正在形成时，实施过程中存在困难，发表的文章很少，生物学发现也有限。相比之下，接下来的几年在应用领域见证了显著的加速，发表了数千项关于神经系统功能及其之外领域的发现和洞见。这篇历史评论文章反思了这十年过渡期的科学景观。

引言

光遗传学是遗传学和光学方法的结合，用于在活体组织和行为动物的特定细胞中引起或抑制明确定义的事件。这项技术，如今被用来研究行为的神经回路基础，最常涉及三个核心特征：(i) 微生物视蛋白，这是一个古老但非常合适的基因家族的成员，适应于进化上遥远的生物体，如藻类和古细菌，每个基因编码一个独特的蛋白质，能够在光照下直接引发跨细胞膜的电流；(ii) 通用方法，用于将足够强和特异性的视蛋白基因表达靶向到大脑中定义明确的细胞元素；以及 (iii) 通用方法，用于在实验对象进行感兴趣的行为时，引导足够强和精确定时的光线到特定的大脑区域、细胞或细胞部分。

十年前，这三种组分中没有一个是为神经科学中的一般光遗传学发现所启用的，甚至在我们一年后提出新词来描述这一新兴过程时也是如此，但每个组分都有追溯到几十年前的科学起源。过去十年中使光遗传学成为可能的交叉整合只有在适当的条件下才变得可能。每个组分也在继续快速发展，以实现更大的精确度和复杂性。事实上，这些光遗传学的基本要素正在越来越多地招募和运用更多的科学与工程学分支，从用于系统识别的计算工具到自动化的行为和神经活动的光学读出，再到用于发现结构和连接关系的高内容解剖数据提取方法。

最新的技术发展，以及实验指南、挑战和限制，已经在今年的详细审查中进行了讨论。在目前的这篇历史评论中，我专注于过去十年中光遗传学转变本身，从围绕早期工作的科学条件到同期应用这项技术所引发的主要发现，这一切都是在三个在起源和传统上几乎不可能更加不同的汇聚学科的背景下进行的。

开发和组装光遗传学组件

这三个组件中的第一个已经是生物化学和生理学数十年来的基本组成部分：微生物视蛋白基因和它们编码的微生物视紫红质蛋白，这是一个功能上完全不同于（并且在原始序列上与）众所周知的脊椎动物眼中介导光转导的视紫红质的分子家族。实际上，自1971年Oesterhelt和Stoeckenius开始的初步证据表明，微生物也可能产生和使用类似视紫红质的蛋白，这既令人惊讶又引人入胜。与它们的脊椎动物对应物不同，这些微生物蛋白大多数不是通过与细胞内第二信使级联反应耦合来间接影响离子通道，而是直接将光子转换为电流。这一分子壮举激发了强烈的好奇心，并激发了数十年来数千次的调查。实际上，仅在几年内，这一发现就催生了一个活跃的社区，该社区每年稳定产出约100篇论文，至今已有四十年，涵盖了对这些微生物蛋白的光循环和机制的基因组、功能和结构研究，并定义了生物学家教科书培训的一部分。

图1 微生物光激活蛋白研究的生化基础。(a) 用于单组分光遗传学的三类主要微生物蛋白（改编自参考文献5，爱思唯尔出版社）。(b) 质子泵菌视紫红质（BR）5的光激活跨膜电流机制。光子（hν）吸收引发构象转变，导致涉及Asp85、Asp96、Asp212、Arg82和质子释放复合体（PRC）的不连续质子转移，以及跨膜的净电荷移动。单组分光激活跨膜离子导电的核心概念到1980年代已成为教科书材料8（转载自参考文献5，爱思唯尔出版社）。(c) 阐明通道型导电。通道视紫红质晶体结构9揭示了跨膜螺旋（绿色）的位置、全反式视黄醛（紫色）的结合口袋，以及排列在孔道内的残基的埃尺度定位（左侧）。在测试孔道模型的过程中，结构引导的突变10对左侧橙色（左侧）的残基进行了改变，预期的孔道电静力从主要是负电荷（红色，中间）转变为主要是正电荷（蓝色，右侧），并切换了离子选择性，从阳离子导电转变为阴离子（氯离子）导电13。(d) 所有三类微生物视紫红质衍生蛋白在一定程度上都受到在后生动物宿主细胞内形成聚集体的影响18,50,51，但在所有情况下，这可以通过从哺乳动物通道借鉴的膜运输信号来解决18,50,51,90。显示：原始BR与增强黄色荧光蛋白（EYFP）融合；左上角显示了在哺乳动物神经元中野生型BR表达所见的堆积，右上角显示了添加神经突靶向信号（TS）对表面膜表达的影响，下行显示了TS和内质网（ER）出口信号共同提供的效果（转载自参考文献18，爱思唯尔出版社）。

这个家族树的三个分支在光遗传学中找到了应用：细菌视紫红质、卤视紫红质和通道视紫红质。自然发生的细菌视紫红质（这个家族中首先发现的成员，它们将质子泵出细胞）和卤视紫红质（将氯离子泵入细胞）通常在神经系统中起抑制作用，因为这两种类型的超极化电流使得神经元更难发放动作电位；相比之下，自然发生的通道视紫红质大多数允许带正电的离子自由流过视蛋白孔，因此倾向于去极化和兴奋性。这一模式保持了许多年，直到高分辨率的通道视紫红质晶体结构允许结构引导的视蛋白通道孔工程，以创建抑制性的氯离子导电通道，然后是2015年发现的自然氯离子导电通道视紫红质。多年来，在自然界中（或在实验室中工程化）发现了这些蛋白质家族中更多的变体，具有更快的动力学、双稳态特性、改变的离子导电性和改变的颜色响应特性；这种多样性现在在光遗传学实验中被强大的利用。

这些蛋白质的关键功能特性几十年来已广为人知，许多研究者已经尝试创建用光控制神经元的策略。那么，为什么将这些蛋白质放入行为动物不同类别的神经元中的方法需要时间来开发和应用呢？如上所述，光遗传学的发展是一个生物学上的三体问题，其中解决这三个挑战中的任何一个都很难（或者更重要的是，激励尝试解决）而不首先解决其他组成部分。例如，预测微生物视紫红质光电流非常小，即使在成年非视网膜大脑组织中能够高效传递和结合全反式视黄醛色素，即使这些在进化上遥远的蛋白质能够安全且正确地转运到复杂的多细胞生物神经元的表面膜上，也预示着前进的道路困难重重。要使这些弱膜电导调节剂工作，必须在活体神经系统中达到高水平的基因表达和光强度，同时实现细胞类型特异性并最小化细胞毒性。尽管众所周知神经元对（过度表达膜蛋白以及对热和光的副作用）非常脆弱，通常容易受到损害或被破坏，但所有这些都必须实现。面对这些未解决的问题，激发对基于微生物视蛋白的光学控制进行探索的专注努力是困难的，而最初的微弱希望之光最终将意味着很多。

在神经科学之外，已经有关于非神经隔离细胞系统中微生物视蛋白的功能性异源表达的例子，用于光激活的离子流动（从20世纪90年代初开始）或脊椎动物视蛋白（从20世纪80年代末开始），尽管并未提出神经科学或行为应用。目前尚不清楚有多少研究者实际上在2005年之前尝试将微生物视蛋白转导到神经元中，但即使在光遗传学所需的众多步骤中的这一步骤，也可能出现很多问题。与此同时，在2005年之前的几年中，人们设计了几种针对目标神经元进行光学控制的其他策略，涉及同时传递多个后生动物基因或协调传递后生动物基因和光敏合成化学物质，或许正是因为它们的优雅，减少了对另一种方法的热情，这种方法完全基于一类更外来的微生物蛋白，看起来不太可能奏效。

时间和努力的分配是否值得，并不是一个微不足道的考虑，因为在2004年，我的实验室小组拥有有限的物质资源；此外，还存在大量的自我怀疑，意识到要达到即使是最基本的初始目标，也需要采取更多同等或更大程度和风险的步骤。然而，一旦观察到具有显著光激活功能的微生物视蛋白在神经膜上的表达（见图2a），并且第一次有可能报告“我认为它起作用了”，局面就从猜测变成了行动。接下来的两年确实在多个层面上看到了行动：构建和集中关键的表达载体，以实现稳定、良好耐受的表达（见图2b），在体外使用电生理学和行为测试实时读出（见图2b、c），然后，至关重要的是在体内进行测试；以及设计（见图2d）和实施（见图2e）用于体内光传递和行为的神经界面2,3,24–26。许多研究者正在讨论可能性并从事相关工作，尽管在2005年和2006年，世界各地的开创性实验室发表了一些论文2,3,27–30，但又是经过两年的艰难努力，哺乳动物行为控制的旅程才最终完成25,26（见图3a、b和补充视频1），最终让人们相信，微生物视蛋白方法是普遍有用的。

图2 整合各个部分。(a) 上图，我实验室第一次微生物视蛋白实验的原始笔记本页面。为了构建神经元控制策略，同时测试了几个通道克隆，包括风险最高的视蛋白表达；2004年7月1日用于转导神经元的构建物和质粒浓度在左上角记录，包括一个通道视紫红质（克隆K43）和野生型（WT）或显性负性（DN）TASK1/TASK3钾通道（K44-47）。宿主神经元是从成年来源的哺乳动物中枢神经系统前体分化而来。中心：神经元表达、定位和光激活；绿色，与通道视紫红质融合的荧光蛋白在直径约为10微米的神经元体和近端树突中的亚细胞分布。在进行光遗传学光刺激和CREB Ser-133磷酸化（红色）检测以报告激活（2004年7月14日）后，激活被记录为逐个神经元计数（底部；z检验，χ2 = 9.0634，自由度df = 3；P = 0.028），然后神经元被转导以进行下一步。(b) 下一步包括设计电生理学、成像和行为读数；设计并引入高滴度视蛋白病毒；以及对转导的大脑区域进行聚焦照明（计划步骤的工作流程显示）。(c) 通过高滴度视蛋白病毒实现了跨实验的稳定、良好耐受、可重复的控制，这对光遗传学至关重要。电生理学读数显示两个培养神经元接收相同光模式的尖峰（改编自参考文献2，Springer Nature）。(d) 用于空间注册病毒转导与聚焦高强度照明的光纤神经界面的初始工程草图（图纸由斯坦福大学的F. Zhang提供）。(e) 实现接口的实例，最终允许深度靶向控制26和观察自由移动哺乳动物细胞和投射的群体水平活动4,111（照片由斯坦福大学的I. Goshen提供）。补充视频1展示了最初的哺乳动物行为控制。

一些曾被认为是体内工作难以克服的问题，结果证明是容易解决的。例如，无脊椎动物可以利用饮食中的全反式视黄醛作为色素28,31–33，未成熟和发育中的脊椎动物神经系统和视网膜不需要补充27,29,30，成年哺乳动物大脑也不需要外源性视黄醛或其他组分3,24–26。有了这些发现，再加上早已知晓的微生物视蛋白将光转换为离子流的单基因逻辑7,8,14，光遗传学已经实现了单一组成——就像绿色荧光蛋白（GFP）一样，这是一个关键的实用性特性。但是，还需要更多的具有挑战性的发现和发展，事实证明，直到2009年才广泛采用微生物视蛋白的光遗传学。随后的转变只有在光遗传学的光学和遗传学组分的融合下才得以实现，这是必须与微生物视蛋白基因结合的第二和第三个领域。在2004年到2009年之间，这些关键领域的发现迅速进展。到2007年初，使用微生物视蛋白光遗传学的新生物学发现只有少数出现，主要来自小型、光学可探测的无脊椎动物系统。例如，在果蝇幼虫中，已经在经典的气味条件作用中测试了不同神经调节剂（多巴胺能与章鱼胺/酪胺能）系统活动的效应31，并且已经定义了伤害感受性神经元在保护幼虫免受黄蜂攻击的防御行为中的作用32。此外，表达视蛋白的哺乳动物大脑表面已经被急性暴露并用光斑照射以驱动和映射响应3,24,34–36。然而，哺乳动物行为的控制尚未实现，实际上，完整的大脑似乎对光遗传学来说基本上是无法接近的。因此，迫切需要通过神经界面安全、聚焦和灵活地将可见光以高强度传递到自由行为哺乳动物大脑的深处：接口输出处约为100 mW/mm²，比视蛋白表达细胞本身所需的强度高约100倍，因为预计在有效脑容量上的散射损失25，而且比成像所需的强度要大得多。当时的LED功率不足以与光纤耦合，因此迫切需要快速发展基于激光二极管耦合光纤的光遗传学界面25,26。除了包括热隔离和活动反馈等其他特性外，这些界面至关重要地还注册了病毒注射到照明部位（图2d,e），这为在行为期间的靶向控制和读出打开了新的实验可能性。

到2007年中（见图3a,b），已经有可能26在成年小鼠大脑深处的特定神经元群体（在这种情况下是下丘脑中的促觉醒素/食欲素神经元）中高度特异性和渗透性地靶向微生物视蛋白基因，通过光纤向这些细胞播放一系列广泛的尖峰模式，同时在自由行为期间收集多模态系统读数（在这种情况下，通过脑电图（EEG）和肌电图描述睡眠/觉醒状态），并证明特定大脑细胞中的活动模式在自然行为（在这种情况下，是睡眠-觉醒转换）中的因果作用26。值得注意的是，尽管后来在那一年报告了通过完整的头骨37或颅骨开窗38使用直接贴附在颅骨上的LED来控制行为的光遗传学方法，但这种方法今天很少被采用，因为LED会产生大量的局部加热，以这种方式传递的光不容易针对定义明确的回路元件，相比之下，光纤方法还允许通过同一接口收集成像光，以报告局部神经活动。这个例子也说明了如何必须以一种基本的方式推进电路组分的遗传靶向，以适应微生物视蛋白所需的高表达水平。在这最初的5年中，该领域相应地看到了多功能的、高滴度的细胞靶向视蛋白病毒3,24–26,39–42的发展，以及最初广泛表达35,36和特定43的转基因视蛋白小鼠系的创建。这些进展得到了以下最初报告的补充：由于在蠕虫（用于兴奋28和抑制33）、果蝇31、鱼44和啮齿动物25,26中的细胞遗传靶向，导致体内行为效应。然而，视蛋白基因的细胞类型靶向不仅仅是通过遗传学实现的。正是光纤硬件方法使得现在最广泛使用和普遍适用的方法之一成为可能，这种方法基于解剖学或连接线对行为中的细胞进行靶向。这种方法被称为投射靶向，涉及使用光纤神经界面指向表达视蛋白的细胞的轴突投射，以招募通过连接线定义的细胞，以控制行为4,45。

图3 光遗传学遗传引导干预的进展。(a) 顶部，基于慢病毒中3.1-kb的下丘脑分泌素（Hcrt）启动子片段，在行为哺乳动物中进行光遗传学细胞类型靶向的初始尝试；右侧是没有视蛋白基因的对照载体26。LTR，长末端重复序列；RRE，Rev响应元素；WPRE，土拨鼠转录后调控元件；ChR2，通道视紫红质-2；cPPT，中心多嘌呤序列；Psi+，顺式包装序列；mCherry，一种红色荧光蛋白。中间，Hcrt神经元（绿色）中表达的特异性、渗透性和效率；小鼠外侧下丘脑中显示ChR2-mCherry融合蛋白（红色）（比例尺，20微米）；右侧，下丘脑切片中的光电流。底部，神经元在照明下发放动作电位；两次扫描叠加。误差条，标准误差均值（s.e.m.）。(b) 光闪烁效应的剂量-反应；在与a相对应的实验中，展示了从快速眼动（REM）睡眠状态经过单次10秒光刺激（15毫秒光脉冲）后觉醒转换的潜伏期在不同频率下的情况（a,b改编自参考文献26，Springer Nature）。误差条，标准误差均值（s.e.m.）。(c) 哺乳动物光遗传学的遗传靶向：使用单个腺相关病毒载体54，基于多个重组酶表达定义的遗传特征，实现AND或NOT视蛋白表达逻辑的条件。左上方，示意图表示选择表达（或不表达）重组酶Cre或Flp的目标细胞群，这些重组酶通常用于创建具有细胞类型靶向重组酶表达模式的动物系。右上方，基于重组后去除内含子中的重组位点的靶向机制54。(d) 转染了Cre（蓝色）、Flp（红色）以及实现Cre AND NOT Flp（Con/Foff）或Flp AND NOT Cre（Coff/Fon）的载体组合的神经元。ChR2-YFP仅在被Cre或Flp中的一种而非两种重组酶标记的细胞中表达（c,d改编自参考文献54，Springer Nature）。

在最初的几年中，与遗传学和光学的发展相吻合的是视蛋白基因组学和工程学的进展。在基础科学领域中，一种不同形式的反向翻译，光遗传学的新机会现在反过来推动了微生物视蛋白的基本研究，包括新结构模型的开发、光循环分析，以及使用现代基因组方法发现视蛋白基因。在光遗传学出现之前，这个领域就已经在蓬勃发展；例如，最终导致光遗传学的两个火花来自于Stoeckenius和Oesterhelt在1971年对微生物中视黄质的鉴定7，以及Hegemann和Harz在1991年对Chlamydomonas中视黄质调节电流的鉴定46。但光遗传学回馈了这个恩惠，为微生物视蛋白生物学领域提供了新的火花。非常相关的是，与早期光学硬件开发同时发生的新蛋白质的发现和工程化，能够利用红移光47，双稳态“步进函数”光电流，可以通过一种波长的光脉冲稳定地开启，用另一种波长的光关闭48,49，更高的细胞光敏感性48,49，以及基于膜运输50,51和嵌合体化52,53创新的更高安全表达水平（进一步促进了改善的细胞光敏感性）。这些视蛋白工程学的进展因此指导并定义了最初光学硬件元素工程的约束（见图2d,e）。通过这种方式，微生物视蛋白、体内光学和表达靶向遗传学最终结合在一起，形成了一个相互依存和互补的整体。尽管在十年的后半段，光遗传学的遗传靶向也进一步发展，用于多特征靶向54（见图3c,d），但即使到2009年，已经有可能实现不仅仅是针对孤立可行案例的细胞类型靶向，而且是以一种普遍适用的方式，使用足够强大和特异性的重组酶依赖病毒39-42来控制行为，以及通过光纤接口实现的投射靶向行为控制，开始超越了对遗传靶向试剂的需求45。这种光遗传学的实验和概念框架允许全世界的研究者采纳、应用和发现。

光遗传学发现

光遗传学方法现在已经使我们能够获得关于行为、生理学和病理学领域广泛问题的洞察，这些领域包括感觉、认知和行动。尽管这些研究中的许多都是在哺乳动物（通常是大鼠和小鼠）上进行的，光遗传学方法也已成为研究无脊椎动物行为神经回路基础的科学界的标准资源。除了简单观察诱发的电活动外，在蠕虫（例如，参考文献55）和果蝇（例如，参考文献56）中揭示了许多关于复杂行为状态调节的迷人生物学发现，而更逐渐地，从光遗传学在鸣禽（例如，参考文献57）、斑马鱼（例如，参考文献58）和非人灵长类动物（例如，参考文献59）等物种中也出现了科学见解。随着单组分光遗传学作为标准研究工具的出现，展现出速度、简单性和多功能性，这些能力部分证明了2013年启动的国家级神经科学研究计划的时间和规模，包括BRAIN倡议60。尽管无法详细回顾该领域产生的全部发现，但值得注意的是不同类别调查中出现的关键示例。

总体而言，光遗传学方法现在已经阐明了在自然以及与疾病相关的生理和行为中定义的细胞类型和投射的因果作用，范围从最基本的稳态到高级认知功能。例如，光遗传学方法现在已经被用来阐明运动调节的因果神经基础43,61，包括识别脊髓和小脑如何调节前脑对熟练和自愿运动控制的意外自底向上的回路机制62–64。已经识别出遗传和解剖学定义的细胞产生的活动模式，即使这些细胞与其他细胞类型混合在一起，也能特别地驱动或抑制生物体最基本的功能：饥饿、口渴和能量平衡65–69；呼吸70,71；以及唤醒、睡眠和昼夜节律26,72–75。此外，使用光遗传学广泛研究了将初级感觉信息传递给大脑的过程，包括在嗅觉76–78、听觉79、视觉80,81和触觉82,83处理领域。

许多研究已经利用光遗传学来发现和绘制大脑中信息流动的途径，包括分析物理回路连接本身84,85，标记按类型或连接性定义的细胞以用于其他分析86，以及与fMRI或PET成像相结合，生成由定义的神经细胞或投射招募的活动模式的大脑范围图87,88。

光遗传学方法也揭示了神经回路中信息传递动态的见解，例如，关于振荡节律调节活动41,89–97，theta节律内相位定时的因果意义98，gamma节律性对信息传播的影响41,89,90，以及（与遗传干预的并行见解99,100相吻合）通过兴奋和抑制的动态平衡实时调节信息流90,101–110。

使用条件性病毒表达的微生物视蛋白基因，并通过光纤界面靶向，已经识别出控制和调节许多动机行为的电路活动模式。社会行为，这对涉及感觉、动机、奖赏、认知和记忆的大脑回路提出了强烈要求，已经在一系列条件下进行了研究，导致识别出调节同性社会模式90,111的细胞和投射，以及与亲代112、交配相关113,114、攻击性相关113–116和防御性115,116互动有关的细胞和投射。对于挑战117和避免风险与寻求奖赏118之间的权衡的研究也已被证明容易通过光遗传学识别所涉及的细胞和电路。事实上，已经对奖赏本身的因果回路基础42,119–124，以及恐惧和焦虑的电路实现125–135有了洞见。在这些情况下，光遗传学使人们能够界定不同类型的细胞，即使它们相邻和交织在一起，也可以在这些复杂行为中发挥根本对立的作用。在这一过程中，大脑功能组织的原则上出现了；例如，揭示了大脑广泛连接的效能和适应性，这些连接由起源和目标定义，因此以前对研究者来说无法进行特定控制，以精确调节行为和行为状态136。长期行动和电模式也已被阐明，从而洞察到细胞活动特定引起的稳定脑状态，这些状态是行为的基础137。

除了大脑和行为状态的动态之外，光遗传学方法也阐明了大脑中信息存储的潜在机制138–140。近年来最令人兴奋的发展之一是对长期持有和广泛争论的神经信息表征模型的测试。巧妙的活动引导表达微生物视蛋白基因的使用，导致了对记忆状态139–142下稀疏和分布式群体表征（记忆印迹）的因果识别，以及这些记忆状态的特征之间的联系。学习本身已经在腹侧纹状体143,144和杏仁核138中通过光遗传学进行了研究，对海马体形成输入的研究也已经在一定程度上进行了研究，以了解其在因果学习、导航和信息流145–147中的作用。最后，精确定时的活动模式在不同的定义良好的细胞类型、投射和群体中已经被因果地牵连到突触可塑性148,149、连接和微电路可塑性150,151，以及在长时间尺度的发育152,153和适应性变化，如活动依赖的髓鞘化154和成人神经发生155,156中。

关于疾病状态相关症状的神经回路，也出现了许多发现；实际上，神经精神疾病的精确回路级机制和因果组织级表现由于许多原因一直是个谜，这些原因也使得光遗传学对基础神经科学有用。例如，光遗传学方法已经被应用于研究癫痫发作传播和终止的细胞活动基础157-159；这些研究及其后续研究包括了在行为动物中的一些首批闭环方法（见图4），以及对远离起始点的立即终止癫痫的高度局部站点的惊人识别158。后者的发现仍在探索中，但如果脑内活动不平衡的渗透不是普遍发生的，而是主要通过令人惊讶地定义良好且分离的节点，可以在这些节点上施加非常有效的点控制（如使用光纤或电极；见图4），那么其意义不仅是为了理解癫痫，也是为了理解大脑作为一个动态系统。

图4 光遗传学活动中引导干预的进展。(a-d) 在癫痫皮层中对丘脑皮层神经元进行闭环靶向（转载自参考文献158，Springer Nature）。黄光通过使用eNpHR3.0（一种工程化的抑制性卤视紫红质）进行闭环光遗传学抑制，在实时检测和中断中终止了由EEG和行为定义的癫痫发作（a,c）。没有黄光，原始的癫痫事件将按照未改变的时间进程发展（b,d）。因此，在这种情况下，意外地识别出丘脑皮层活动对于中风后的癫痫事件是必要的。(e) 2009年的光遗传学闭环控制。对表达ChR2的抑制性（FS）神经元进行光遗传学刺激，以在锥体（PY）神经元中检测到尖峰为条件，实现实验者控制下的前馈抑制（改编自参考文献41，Springer Nature）。黑色和红色轨迹分别显示了在未使用和使用闭环光遗传学兴奋FS细胞的情况下PY细胞的动作电位。(f) 可以实现闭环、全光学控制，使用深脑荧光（例如，GCaMP）检测基因指定的活动信号，通过如光纤光度测量技术（此处显示实时检测在社交互动期间腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元投射到伏隔核（NAc）的活动）111。红色条表示互动事件（社交或物体）。(g) 具有闭环控制投射动态的相当潜力，同样的光纤接口25,26不仅可以用于观察定义好的深脑投射中的活动，还可以用于控制深脑投射中的活动，如此处所示调节社交行为（f,g改编自参考文献111，Elsevier）。这些方法补充了基因指定的活动中视蛋白表达的方法139。

在神经学领域，光遗传学研究也导致了确定促进或抑制正常和帕金森病运动模式的细胞和途径45,61。后者的研究包括了在健康或帕金森病条件下，纹状体直接和间接途径在行动启动和抑制中的对立作用的初始特定和因果演示61——在这种情况下，解决了一个长期存在的问题，这个问题以前不容易直接测试，对于理解疾病以及理解适应性运动调节都有明确的意义。

关于光遗传学是否会直接以治疗方式应用（例如，通过直接的病毒途径160或引入光敏感细胞161）的全面讨论超出了这篇历史评论的范围。然而，从实验室得出的关于不良行为的回路级见解在科学上是重要的，并且反过来将反馈并增强对疾病状态下出错的自然回路和过程的基本研究。光遗传学已经被用来识别肿瘤和退行性过程，例如神经元中的活动依赖的双链DNA断裂162，阿尔茨海默病模型小鼠中慢性中等活动增强的淀粉样β病理163，活动驱动的神经配对蛋白-3分泌介导的胶质瘤生长改变164，以及亨廷顿病小鼠模型中改变的纹状体抑制165，所有这些都通过在表达微生物视蛋白基因的特定细胞群体中精确启动的活动进行了测试和调节。研究了再生过程，包括通过卤视紫红质恢复视网膜色素变性的光反应166，新皮层长距离投射的活动依赖性髓鞘化改变154，以及中风后的恢复和重连过程167,168。

尽管成瘾药物效果的全脑复杂性看似难以处理，我们在临床上也难以用药理学方法治疗这些疾病，但光遗传学方法已被用于发现能够强大且特异性控制可卡因相关行为表达的细胞和突触119,120,169–171。例如，光遗传学方法被用来解决有关伏隔核中小群（约1%）胆碱能细胞在控制急性可卡因条件作用中的因果角色的争议119。此外，一系列令人惊讶的论文揭示了前额叶皮层对长期可卡因引发的行为模式的聚焦启动控制的强大力量169–171，这可能与理解如何以自上而下的方式建立和特异性调节稳定的行为模式有关（也见于关于光遗传学调节皮质-纹状体控制强迫性行为机制的一对论文172,173）。

总体而言，通过确定大脑中招募、组装和协调影响行为状态的特征（例如，改变的动机、奖赏、社交互动和焦虑）的机制，光遗传学已经阐明了精神疾病136。这些症状领域在不同的临床状况下是共享的，尽管具有不同的品质和不同的组合117,128–130,133。当一个投射被靶向时，症状领域特定的行为后果可以以一种比单独调节该投射的起源结构或目标结构的活动更为特定和/或有力的方式来表现4，如在不可克服的挑战情境下从积极应对到被动应对的行为策略转变117。特别是，研究发现，前额叶皮层到背侧拉普斯（dorsal raphe）的特定长距离投射能够促进（当光遗传学解析并兴奋时）或抑制（当光遗传学解析并抑制时）自动化强迫游泳测试中的游泳和攀爬行为117，这对理解在健康和疾病中情感状态可能变化的成本/努力关系评估和分配具有意义。对于投射目标、投射起源或不同靶向至哈伯那（habenula）的投射的控制，观察到的效应则不那么特定、缺失或方向相反117。这类光遗传学研究的一个共同主题是识别具有对个体症状领域有机械贡献的明确细胞群（或这些细胞产生的投射），揭示了具有解释力的因果映射，适用于适应性和不适应状态。来自临床启发方面的发现，与来自基础科学方面发现一起，不仅导致了这些广泛概念的出现，还解决了长期存在的问题。

当前实验的考虑和挑战

与任何科学方法一样，存在着重要的技术限制和潜在的混杂因素，这些因素为从业者所知，并在多年来得到解决4,37,136,174，并在此为完整性进行讨论。严谨的光遗传学需要仔细考虑：(i) 控制实验系统本身的影响，(ii) 定义所传递的刺激模式，以及 (iii) 定义直接调节的组织元素。这些是生物学中任何干预的一般考虑，尽管光遗传学为特异性和验证特异性的方法提供了新的机会。

首先，考虑实验系统需要考虑光传递本身和视蛋白基因本身的影响。关于光传递，灵活的光纤接口与过去数十年来自由移动系统神经生物学中使用的电气接口相比，更小、更轻25,26,174。这个光学接口进一步实现了两个新能力：用于行为控制的投射靶向45,121,128，以及在行为期间对细胞和投射活动的读出4,111。然而，细心的行为学家必须在接口安装的情况下进行基线行为测试，以验证每个队列和每个实验对象的任务。此外，行为实验的标准做法是包括无视蛋白臂，其中动物接受准备的每个其他方面，包括病毒转导和光传递；这些对照解决了许多理论上的问题，从手术的毒性副作用到光本身的干扰或加热效应174。值得注意的是，对于电刺激，要建立这样的对照会更加困难，以这种方式提供相同的能量，以至于组织无法功能性地响应。光遗传学实验既需要也使得这样的控制成为可能。

关于视蛋白基因表达本身，与任何外来或本地基因（特别是那些编码膜蛋白的基因）一样，用于光激活和结构及功能读出的基因带来了在高表达、长期表达环境下可能出现毒性效应的风险。这是可以解决的45,50,51，现在在哺乳动物中表达的每一种主要类别的过度表达的微生物视蛋白（质子泵、氯泵和通道）已被证明受益于提供哺乳动物膜运输信号18,45,50,51,90，以促进蛋白质生产途径到细胞表面膜的高效运输。避免某些病毒（例如，狂犬病和疱疹病毒）的长期表达或某些过于强大的启动子/增强子组合（例如，在许多情况下基于CMV的启动子174）也很重要，光遗传学实验应包括在实际可行的情况下，对细胞健康的组织学和/或电生理学验证，以及与非视蛋白表达细胞或动物的基线比较。当然，在大多数情况下，每个动物也可以作为自己的光关闭/光开启/光关闭对照，以验证实验真正读出的是激活的效果，而不是准备或随时间变化的效果——这是在其他方法（如损伤研究）中难以实现的对照。

其次，定义所传递的刺激模式对于充分利用光遗传学控制的能力至关重要。光脉冲模式可以从不可检测到病理性结果的广泛范围内进行映射，同时读取感兴趣的行为和生理学（例如，参考文献26），或者可以调整以匹配记录研究中观察到的各种不同模式（例如，参考文献42）。此外，当光遗传学被用作回路级工具（通常是这种情况）——例如，研究一个细胞群体对不同大脑区域另一个细胞群体的影响——在突触前细胞群体中光遗传学引发的动作电位序列是由本地的电压门控钠通道产生的，并作为尖峰传播到轴突末梢，在那里它将容易受到与具有相似速率和时间的本地动作电位列车相同的突触前可塑性机制（例如，通过可释放的囊泡池动态）和突触后可塑性（例如，通过受体内化和磷酸化）的影响。当然，光遗传学在细胞内研究中可能会遇到更多挑战，因为被研究的区域也是被照射的区域，因此非生理分布的光激活通道和细胞内电压变化的异常相对时序可能导致细胞内可塑性和细胞信号的人工模式；因此，通常不推荐这种方法。

目标人群中细胞活动的相对时序也很有趣，尽管描述这种关系的实验数据通常没有以有意义的形式可用。然而，就像人群活动的幅度一样，人群的相对同步性也可以通过光遗传学进行调节。在一个极端，使用双稳态步进函数光遗传学工具48,49,90或对传统微生物视蛋白表达细胞进行微弱的持续光传递，可以轻松实现人群内兴奋性的亚阈下调节（而不直接驱动尖峰）；在这些情况下，尖峰时序是异步的，取决于每个细胞的本地突触输入模式48,90。在另一个极端，可以通过非常强烈但短暂的光闪烁实现与在体局部场电位或EEG振荡期间观察到的水平相当的同步性，尽管（就像本地突触驱动一样）细胞和突触历史的变异将不可避免地导致尖峰潜伏期的变异。随着该领域能力向独立控制人群中多个单细胞（图5；最近通过双光子照明优化的视蛋白175和行为期间的空间光定位176,177,178实现）以及通过活动历史定义的稀疏、分布式细胞群的光遗传学控制139,142发展，人群内相对时序将成为越来越有趣的实验途径。光遗传学在这一领域提供的实验杠杆作用扩展到促进使用光学或电学手段177-180在同一动物中检测到的本地活动模式，其中这些活动模式随后可以通过光控制重现。例如，最初使用微生物视蛋白进行红光兴奋和抑制的神经演示18,90已经开始实现光遗传学控制与蓝光响应的、基因编码的Ca2+指示剂4,177,178的整合，甚至通过同一光纤接口4。关于定义所提供活动模式的光遗传学实验杠杆作用进一步来自避免电刺激易受的种群间同步性混杂，例如无意中驱动非目标纤维或区域的传入纤维136。

图5 光遗传学空间引导干预的进展：超越细胞亚群或投射靶向。(a-d) 初始的体内双光子、单细胞分辨率的引导光光遗传学：在成年小鼠中对尖峰进行光遗传学控制（改编自参考文献175，Springer Nature）。(a) 实验设置，使用C1V1针对浅层2/3体感神经元（参考文献175）。(b,c) 在体感皮层中转导的神经元，用填充细胞的荧光染料版本的视蛋白病毒显示在低倍（b）和高倍（c）放大下，该病毒用于促进细胞识别、成像和控制175。(d) 左侧，层2/3的锥体细胞在松散贴片条件下用C1V1转导（注意红色染料填充的贴片电极）。左下方，示踪显示使用1,040纳米栅格扫描照明进行5赫兹控制尖峰。右侧，体内双光子光遗传学尖峰控制的轴向（上部）和侧向（下部）单细胞分辨率。蓝色三角形指示锥体神经元，红色框表示感兴趣区域的栅格扫描定位；示踪仅在细胞内扫描时显示尖峰发生。(e) 使用时间聚焦的双光子控制C1V1进行单细胞靶向的光遗传学示例，在行为小鼠的虚拟现实环境中进行单细胞分辨率的光学反馈（改编自参考文献177，Springer Nature）；关于与C1V1一起使用空间光调制器，参见参考文献175,176,178。目标神经元通过时间聚焦的体大小斑点（<15微米）依次被照亮。左侧，光路；中间，使用的激光器；右侧，行为准备177。PMTs，光电倍增管；ex.，激发；em.，发射；HP，头板。

第三，定义和验证直接调节的组织元素至关重要——在光遗传学中可以达到以前不可能的水平，但因此更需要适当的实验设计和解释4。首先且最重要的是，任何针对细胞类型或群体的策略——无论是通过遗传学、解剖学、引导光或其他手段——都必须在进行行为或生理学研究的同一制备物中进行验证，特别是因为启动子和驱动线可能没有在不同实验室、动物和科学问题的精确亚区或发育阶段中精确转换的特异性属性4。为了解决这个问题，通过GFP或相关融合蛋白跟踪视蛋白的表达，或对共表达标签进行染色，并与内源性细胞类型标记物相关联（反过来用抗体、转基因荧光标签、解剖学和形态学标记或描述）。非目标群体的保留（特异性）当然比成功接触目标群体（渗透性）更重要，并且必须量化。

基于解剖学而非（或除）遗传学的靶向也是光遗传学中广泛实践的，并且需要类似的验证关注；一些方法涉及各种形式的逆行追踪，用于将执行器表达靶向到投射到注射大脑区域的神经元，而其他策略涉及顺行靶向136。后者方法的一种版本，称为投射靶向，涉及在上游神经元群体中表达光遗传学工具，然后通过将光传递限制在目标大脑区域，选择这些神经元的输出定义的子集，这些区域将包含由投射起源和目标定义的光敏轴突，位置在行为期间在体内区分路径128。含视蛋白的轴突的兴奋可以导致逆行尖峰传播到大脑中的细胞体和轴突侧枝45；随着该领域向越来越现实的活动模式输入的转变，完全招募一个接线定义的细胞类型作为一个功能单元变得越来越受欢迎，因为单独孤立的轴突侧枝的兴奋不太可能自然发生。然而，对于实验上可能需要隔离特定侧枝的情况，抑制对于保持直接效果的局部性很有价值128,136，并且在兴奋时，如果需要，细胞体的药物活动阻断可以提供更多的特异性。兴奋和抑制都是投射靶向的广泛使用形式，用于测试接线定义细胞的充分性和必要性；如上所述，与简单的区域靶向相比，通常可以看到行为效应的分辨率提高4,117,136。

光遗传学及其伴随技术的未来

光遗传学作为一个领域，在某些情况下推动并发展了后来对非光遗传学方法有用的技术发展；例如，为光遗传学控制开发的基于光纤的神经接口现在也用于记录自然活动信号111，用于帮助视蛋白在高水平安全表达的膜运输信号179，以及最初为靶向微生物视蛋白而开发的重组酶依赖病毒39-42，现在用于以通用方式靶向多样化基因69,111。但光遗传学技术现在也能够利用其他领域出现的技术进步。例如，双光子显微镜帮助实现了活体哺乳动物大脑中单细胞的精确时间控制（图5）175-178，而基于液晶的全息术允许使用空间光调制器控制多个单独定义的细胞176——这些都是在行为动物中使用电或药理方法不可能实现的长期目标。

这种方法的最大承诺——在行为期间以衍射限制的空间和时间分辨率分别控制哺乳动物大脑中的所有细胞——不太可能实现，部分原因是由于包括光散射和与针对大量单独指定细胞相关的功率沉积要求在内的基本物理挑战。但光遗传学记忆印迹研究139得出的一个重要结论是，不仅光学，而且遗传学也可以用来实现光遗传学中多个单独细胞的控制；当然，两者的强大交叉也是可能的，并且肯定会成为光遗传学未来的一部分。当与靶向视蛋白的遗传方法一起工作时，光引导的光学方法现在可以方便地控制感兴趣的细胞，以一般方式研究自由行为动物的生理学和行为，而新类别的光学器件、光源和计算方法的发展将继续为光遗传学控制开辟新途径4。

使用非光遗传学技术收集的数据流进行光遗传学实验也将变得越来越普遍，实际上也变得至关重要136,180。使用光遗传学传递由原生活动模式引导的活动模式具有重大价值，无论是在细胞、投射、组合、类型定义的群体或其组合的水平上4。最近在神经活动读出方法（包括生物传感器和硬件领域）177-180以及用于检测和实时反馈这些活动信息以实现活动引导控制的闭环方法4方面的进展，为光遗传学提供了新类型的实验途径，这些实验大大增强了光遗传学的实用性（图5）。

尽管在2007年（参考文献26）就已经可以使用电生理读数来控制行为，但早期的研究本质上都是开环的。然而，在2009年这个十年的中间点，也标志着闭环光遗传学的开始41（见图4）；在这项研究中，反馈被用来以一种有原则的方式引导刺激，因为观察到的锥体神经元的尖峰触发了副胝胍蛋白抑制性神经元的驱动，以实现和研究定义良好的回路级反馈型抑制41的因果后果。这种相对于神经活动事件的光遗传学控制的精确定时已经成为该领域中增长最快的方法之一4，也是最重要的方法之一；例如，已经发现光遗传学干预的效果取决于内源性振荡阶段和感觉信息的可用性98。然而，提高闭环控制中反馈的速度和精度，取决于大脑和行为状态，将是一个重要的工程挑战，这将与检测神经活动（如使用基因编码的荧光传感器）和行为活动（如使用机器视觉方法）的新技术的发展，以及开发用于实时提取这些有意义的读出模式的计算工具的发展齐头并进4。

像导致这些新的细胞分辨率活动数据流的进展一样，最近在解剖学方法上的进展，产生了局部和全脑连接数据集，现在为广泛的其他实验提供了可解释性和能力——例如，在识别在行为期间具有特定活动模式的组分136方面。原则上，现在可以将这些结构和解剖数据集与涉及的细胞和组合的因果影响的知识联系起来。获取、存储、分析、形态变化和注册这些大型数据集的每个方面都不是小事，这反过来又推动了数据共享、集群计算和手动和自动工具的数据集分割和注释的交叉验证。

开发光遗传学工具的推动也促进了对微生物视蛋白本身的研究。例如，通过长期努力创造抑制性通道视紫红质，首先获得了高分辨率晶体结构（在这种情况下，为了这个目的而设计的高表达的嵌合体通道视紫红质C1C2）9，然后通过结构引导的孔工程10将蛋白质从阳离子通道转变为氯离子通道10,11；以及随后发现的自然发生的氯离子通道12,13，这项工作一方面扩大了抑制性通道工具箱，另一方面也推进了对孔的理解。同样，红移通道视紫红质VChR1（参考文献47）的发现，导致了最初的红光激活的通道视紫红质C1V1（参考文献90），这不仅深化了对通道视紫红质光谱多样性的理解，也为体内单细胞双光子控制和与基因编码的活动成像读出175-178的整合提供了新的技术能力。

新单组分光遗传学工具的发现和工程化在许多方面进行，不仅限于微生物视蛋白，例如使用感光LOV（自然发生的光-氧-电压蛋白）结构域对钾通道进行工程化181。实际上，使用微生物视蛋白的光遗传学发展也创造了在非微生物视蛋白策略中有用的工具，这一过程可能会持续（见图6）。从2009年开始，神经元中的单组分光遗传学超越了微生物视蛋白，同时仍然利用新组装的光遗传学工具箱。首先出现的是创建光激活的调节剂，用于定义的细胞内分子信号通路的一体化方法。这些策略最初提供了异源三聚体G蛋白、小GTP酶、环核苷酸或直接转录调节因子的招募。首先进行测试的是optoXRs182：G蛋白偶联的视黄质蛋白与G蛋白偶联的信号受体之间的单蛋白嵌合体，用于光敏性和信号特异性183，设计并测试用于行为动物的神经元表达182。最初的optoXRs是哺乳动物表达优化的光激活的α2肾上腺素能受体和β1肾上腺素能受体，用于控制行为182；随后许多小组的工作将optoXR工具箱扩展到了μ-阿片受体184,185、腺苷2A受体186、5HT1A受体187、代谢型谷氨酸6型受体188和多巴胺1型受体111，通常使用与微生物视蛋白174,182相同的光纤界面和重组酶依赖的病毒靶向技术实现体内控制和新的的行为发现。正如在化学遗传学189中一样，其中过度表达的GPCRs通过合成配体进行驱动，optoXR方法可能会被批评为在相对于天然通路招募机制的水平上驱动G蛋白介导的信号通路，这些水平可能太弱或太强。原则上，optoXR方法的快速激活和可逆性可以促进从弱到强的参数映射，就像微生物视蛋白光遗传学一样；随着适当的信号通路招募和活动调节的伴随读出的发展，就像电控制一样，生化光遗传学可能会朝着活动引导和闭环控制发展，以达到新的精确度水平。

图6 主题的变体。(a) 光遗传学控制组蛋白乙酰化和基因表达。LITE系统193使用光响应的隐花色素，而非微生物视蛋白，并已适应于使用TALE试剂创建针对特定基因组序列的组蛋白效应器（左侧）。TALE，转录激活因子样效应器；CRY2PHR，隐花色素-2光解酶同源区域；CIB1，与CRY2相互作用的伙伴。为微生物视蛋白开发的相同激光二极管/光纤光遗传学接口（中间）可用于体内控制此光遗传学系统（右侧）（改编自参考文献193，Springer Nature）。ILC，前扣带回皮层；SID4X，四个串联的mSin3结构域用于组蛋白效应器控制。(b) 左侧，通过引入的纳米颗粒（MNP）和TRPV1温度敏感离子通道基因，将磁信号多组分转导为神经活动（左侧）。中间，带有聚丙烯酸涂层（蓝色）和聚乙二醇链（橙色）的纳米颗粒。右侧，磁场暴露系统。（改编自参考文献195，AAAS）。(c) 通过直接靶向细胞的纳米颗粒将光学信号多组分转导为神经活动（如b，必须通过组织分布）；所需的光强度比微生物视蛋白光遗传学所使用的光强度大得多（改编自参考文献196，Elsevier）。(d) 通过optoXR方法对神经元中定义的生化途径进行单组分控制182。IP3，肌醇三磷酸；DAG，二酰甘油。(e) 信号特异性的生化验证182；optoβ2AR响应光（绿色条）招募cAMP途径至与直接药理学激动原始G蛋白偶联受体（蓝色条）相当的水平，同时不招募其他途径182；相比之下，其他optoXR招募不同的信号机制111,184–188。(f) 用于活动记录的光电极方法182。与图a所示的LITE系统一样，生化系统继续利用为微生物视蛋白光遗传学开发的电生理学和行为的神经接口26,25,37（d–f改编自参考文献182，Springer Nature）。

在单组分optoXR方法被证明可以通过招募异源三聚体G蛋白通路在行为闭环实时位置偏好任务中调节行为182之后，2009年晚些时候使用LOV结构域实现了单组分对小GTP酶（Rac1）通路的控制，通过创建构象改变的蛋白质-蛋白质相互作用，并允许通过招募到质膜来激活小GTP酶190。随后，鉴定了微生物光激活的核苷酸环化酶191,192，使用称为LITEs193的隐花色素衍生工具实现了直接光激活的转录和表观遗传状态调节（见图6a）。

尽管这些随后的单组分光遗传学策略并非使用微生物视蛋白进行，但它们现在以几种重要方式补充了基于微生物视蛋白的光遗传学。首先，作为单组分方法，这些试剂也提供了时间上精确且可重复的效果，这些效果利用了为微生物视蛋白方法开发的遗传靶向和光纤接口工具（例如，参考文献111；图6）。其次，这些工具的时间尺度较慢，以及先前确定的微生物视蛋白的步进函数双稳态变体，提供了与典型微生物视蛋白快速作用互补的更长时间尺度的功能。第三，尽管微生物视蛋白已经证明了它们在非神经元环境中的实用性，从干细胞161到心脏细胞194到星形胶质细胞45,70，但生化单组分光遗传学方法在2009年开始真正为任何细胞的光介导控制打开了大门。光遗传学的中心概念，即在复杂功能的生物系统中的目标细胞类型中光学提供或删除定义良好且精确定时的事件，在生物学的整个领域中都是有用的，过去十年的后半段见证了非神经元和非电性质的单组分光遗传学的增长（图6）。

现在有时直接对比其他候选的干预方法：例如，没有光的光遗传学195或没有遗传学的光遗传学196,197。非光学的基因靶向控制方法将继续被探索用于其他信息传递方式——包括热、超声和磁性，正如它们对化学189所做的那样——以及非遗传的干预方法将继续通过靶向表面蛋白而不是通过外源基因表达来探索控制细胞类型的方法197。这些努力是有趣的，并且将进一步追求，以提高速度、信噪比、与自由行为的兼容性和最小侵入性。这类努力的一个主要类别涉及热激活，其中纳米颗粒作为可见光、磁性或射频能量的天线，用作局部加热的来源，然后使用基因传递的热响应离子通道（如TRPV1家族）将其转换为神经活动（图6b,c）。这些方法虽然创新，但面临与纳米颗粒在密集组织中的扩散特性、可能比微生物视蛋白高数个数量级的巨大能量需求、大量的基础或未刺激活动以及与多组分性相关的挑战（包括与神经编码和动态的速度、时间精度和靶向性）相关的挑战。然而，即使在这些重要参数中的一个或另一个表现不足时，这些额外的策略总是有价值的，因为它们通过增加正交性来补充光遗传学方法，实现多维组合控制，在仅使用光时由于视蛋白的广泛作用光谱而遇到的控制通道数量限制。

回顾过去的十年，提出了一个在光遗传学背景下始终值得向公众传达的最终观点：探索性基础科学研究的基本价值，即使是对于那些主要关注健康和转化研究的研究人员、机构和资助机构也是如此。这里描述的最初实验似乎不太可能由典型的资助计划资助，因为这些计划关注的是疾病状态、转化问题，甚至是基于充分理由的基础科学。尽管这里没有讨论临床和商业应用，但基于微生物视蛋白的光遗传学的进步可能会为神经和精神疾病状态以及其他临床条件的病理生理学和治疗提供信息，除了上述构成光遗传学核心动机的广泛基础科学发现。通过这种方式，过去十年的进展（见图7）不仅揭示了大脑的许多信息，也揭示了科学过程的一些东西。

图7. 过去45年中微生物视紫红质和光遗传学的出版物时间线。图中显示的是通过PubMed搜索可得到的每年关于细菌视紫红质（三角标记）的论文数量；第二条轨迹（方块标记）显示了通过包括其他相关努力的关键词（如：嗜盐菌视紫红质、通道视紫红质或光遗传学的各种变体）可搜索到的论文数量。注意，开创性的细菌视紫红质文献稳步发展，直到2010年才被该领域的其他研究超越。图中标出了与细菌视紫红质7、嗜盐菌视紫红质198,199和通道视紫红质15,46,200相关的关键开创性论文。论文计数：基于2015年7月1日对PubMed的搜索结果。图中用橙色展示了单组分光遗传学最初的5年，在这期间发表的论文较少，而接下来的5年（至当前时间）用蓝色表示。2015年的圆形符号代表基于前6个月的线性外推。

有时会注意到，通过膜片钳技术，直接探测并倾听一个活生生的、处理中的、响应的神经元的内在运作，对于电生理学家来说，这种兴奋感从未完全习惯——无论是经过多少年或测过多少神经元。在光遗传学中，当研究人员观察到在控制特定细胞和投射时，受试者的行为和生理在实时变化时，也会感受到类似的联系——这种联系在多年后仍然令人兴奋。与光的联系连接了实验者和受试者，而且在某种意义上也跨越了生命之树：微生物DNA再次回到了真核细胞中，这是地球上数十亿年来生命的一种反复出现和好奇的主题，为我们提供了另一种共生关系，这一次是科学的。这样的关系一旦形成就会共同进化并持续存在，尽管未来几年生物学作为一个整体将继续以意想不到的方向前进，但古老的微生物视蛋白现在似乎已经成为我们旅程中不可分割的一部分。

注：任何补充信息和源数据文件都可以在论文的在线版本中找到（https://www.nature.com/articles/nn.4091，点击“阅读原文”可跳转）。

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