Ras基因和治愈癌症的漫长竞赛
It took a long, long time: Ras and the race to cure cancer
翻译：鼠来宝生物
四十年前，RAS致癌基因在癌症发展中的作用的发现，为证明肿瘤发展是由改变癌细胞基因组的体细胞突变所驱动的打开了大门。这些发现导致了对癌症发病机制的简单性以及如何治愈癌症的幻想。
正文
要正确看待RAS研究，需要回顾20世纪70年代初癌症研究界的思维方式。当时，多条研究线索导致了这样的假设——实际上是一种猜测——癌症的起源可以追溯到由肿瘤细胞携带的突变基因。这一观点得到了布鲁斯·埃姆斯 (Bruce Ames) 的强烈支持，他证明了多种有机化合物的致癌能力与它们各自的突变能力在许多数量级上是相关的。这种相关性引发了这样的猜测：癌细胞携带有突变基因，这些基因以难以理解的方式作用于肿瘤细胞表型。
当时，这些突变基因的本质是广泛猜测的话题。这种情况随着1976年哈罗德·瓦姆斯 (Harold Varmus) 和J.迈克尔·毕晓普 (J. Michael Bishop) 的报告而改变，他们报告说，劳斯肉瘤病毒（RSV）的转化能力可以追溯到一个正常的细胞基因（即原癌基因），这个基因是前病毒从正常的鸡基因组中窃取并激活成强大的致癌基因的。他们工作的更深远的洞察力是意识到，脊椎动物细胞的正常细胞基因组在其成千上万的其他基因中，至少携带了一个基因，当适当改变时，可以变成一个强大的转化致癌基因，即一个能够推动正常细胞转化为癌细胞的基因。
鉴于瓦姆斯-毕晓普发现的特定路径涉及一种鸡逆转录病毒，似乎很可能其他发现路径最终会揭示存在于细胞基因组中的其他潜在转化基因。事实上，在接下来的五年里，对其他急性转化逆转录病毒的研究扩展了瓦姆斯-毕晓普的工作，表明src原癌基因是正常脊椎动物基因组中几十个类似作用基因的典范，这些基因携带潜在的转化能力。
瓦姆斯和毕晓普1976年的发现以及霍华德·特明 (Howard Temin) 的早期工作带来了另一个概念上的后果，证明同样重要，甚至更重要：少数逆转录病毒相关基因，可能只有一个基因，可以压倒，实际上支配着病毒感染细胞的更复杂的基因组，其拥有数万个基因，并能够随后策划肿瘤细胞表型。因此，正常细胞转化为肿瘤衍生物似乎并不依赖于一大群协作致癌基因的协同作用。这种洞察力对于当时的分子生物学家来说是一种解放，他们依赖于在原核和真核细胞中的实验模型，其中可测量的表型可以追溯到单个因果基因的作用。
尽管如此，RSV研究与理解人类癌症发病机制的相关性仍然不清楚。到了70年代中期，检测逆转录酶酶活性和积极复制的逆转录病毒的试剂的可用性，有效地排除了逆转录病毒在几乎所有人类肿瘤发病机制中的参与。对一些人来说，这种失败是一个重大的失望，因为尼克松总统在1971年发起的抗癌战争，在很大程度上是受到逆转录酶的发现和最终确定潜伏在人类肿瘤中的致病因子的前景的启发，这些因子显然是逆转录病毒。在1976年，RSV研究人员对发现v-src致癌基因将导致在人类肿瘤基因组中发现突变同源物抱有热情。这一观点因随后几十年未能在人类肿瘤基因组中找到src基因的突变版本而受到破坏，除了少数结直肠癌（CRCs）。
这些失败留给我们一个重要的机制假设未经测试：癌细胞基因组携带有突变的细胞基因，这些基因负责组织这些细胞的肿瘤细胞表型。在麻省理工学院我的实验室中进行的一系列迂回的实验最终验证了这一假设。这始于我们使用DNA转染技术研究逆转录病毒分子生物学。具体来说，我们能够将莫洛尼小鼠白血病病毒在感染细胞中产生的DNA逆转录产物转染到小鼠NIH3T3细胞中；正如我们发现的，转染了病毒DNA的细胞能够产生传染性病毒粒子。这本身就证明了这些逆转录病毒的基因组DNA分子携带了这种逆转录病毒的全部关键基因组信息——回顾起来，这个结果几乎似乎是显而易见的。
更有趣的是来自哈维鼠肉瘤病毒（HaSV）的DNA基因组的转染。在这种情况下，我们不是检测后代白血病病毒粒子，而是扫描NIH3T3细胞的单层，寻找转化细胞的焦点，即那些由于获得转染的病毒基因组而失去接触抑制并长成容易识别的焦点团的细胞。
我们对哈维肉瘤病毒（HaSV）的工作直接来自美国国家癌症研究所（NCI）的Scolnick实验室的研究。与Varmus-Bishop实验室平行工作，Edward M. Scolnick的团队专注于小鼠而不是禽类逆转录病毒，更具体地研究Kirsten肉瘤病毒（KiSV）和HaSV。早在1973年，他的实验室就报告说，KiSV携带与小鼠和大鼠逆转录病毒同源的序列，为急性转化的哺乳动物逆转录病毒可以通过与彼此的重组而产生创造了先例。
接下来的一年，他们写道：“结果支持这样一个模型：Kirsten和Harvey肉瘤病毒都是通过小鼠C型病毒和大鼠细胞序列之间的重组或重排过程产生的，这表明转化成纤维细胞的信息可能包含在大鼠C型或细胞基因组中。”
两年后，其他人推测性地写道：“我们的结果为支持这样一个假设提供了证据：与产生C型小鼠肉瘤病毒转化活性的过程类似的过程，也可能对许多（但不是全部）自发和致癌物诱导的大鼠恶性肿瘤负责。”
在某个时候，我研究小组的Mitchell Goldfarb转染了以前被HaSV颗粒感染和转化的小鼠细胞的基因组DNA。似乎这个DNA由正常的小鼠基因组DNA加上染色体整合的HaSV前病毒组成。从这些细胞制备的DNA转染实际上产生了转化的受体细胞。
对我而言，这个特别的结果像一道闪电一样击中了我，因为它揭示了转染焦点检测法足够敏感，能够揭示少数HaSV前病毒的存在，可能只有一个，集成在一个可能携带着与无关细胞DNA相比有百万倍过量的基因组中。这让我反过来推测，人们可能会利用这种转染焦点检测法来研究缺乏任何逆转录病毒关联的癌细胞的DNA。相反，这些细胞是通过反复暴露于一种突变原性化学致癌物而在体外转化的。从理论上讲，这些细胞应该携带一个单拷贝的突变细胞基因，它像一个致癌基因一样起作用，并且负责正在研究的癌细胞的突变表型。
本着这个想法，1978年，刚到的博士生Chiahoh Shih开始转染被3-甲基胆蒽（MC）转化的小鼠细胞株的基因组DNA，这是一种高度突变原性和强致癌性的代理。经过数月的尝试，Shih最终在1979年初证明，转染了某些MC转化细胞基因组DNA的受体细胞单层产生了清晰的转化细胞焦点（图1）！
图1 证明了经诱变剂处理的转化细胞携带突变转化致癌基因，这取决于转染NIH3T3细胞中的焦点评分。像这样的焦点代表了存在转化癌基因的主要证据（来源：Weinberg实验室）。
不久，他和实验室的其他人展示了由乙基亚硝脲诱导的神经外胚层肿瘤的DNA具有类似的转化能力，到1981年，人类膀胱癌基因的DNA也是如此。这些成功表明，由各种类型的癌症和神经外胚层肿瘤携带的致癌基因，无论其确切性质如何，都能通过转化小鼠成纤维细胞来跨越组织和物种界限。很快，Geoffrey Cooper、Mariano Barbacid和Michael Wigler的实验室报告了类似的结果。最终，来自EJ/T24人类膀胱癌细胞系的膀胱癌基因吸引了最多的关注，部分原因是其强大的转化能力。
这些发现引发了一场克隆膀胱癌基因的竞赛。原则上，我们缺乏可以用来检索这个基因的DNA探针。没有手头的探针，我的研究小组开发了一个费力的实验策略来分离这个人类致癌基因。经过一些艰苦的克隆，Shih确实恢复了基因，只是得知膀胱癌基因实际上是Harvey ras（HRAS）原癌基因的一个突变等位基因，其他人几乎同时报告了这一发现。
对我们来说，这种认识带有苦涩的讽刺意味：我们花了半年多的时间通过追踪引入转染、转化的小鼠细胞中的人类序列来分离膀胱癌基因，只是得知我们本可以几乎一夜之间使用一个DNA探针克隆这个基因，这个探针当时就在我自己的实验室套间的一个实验台旁边使用。
使用限制性内切酶作图对克隆的膀胱癌基因进行初步鉴定表明，它在结构上与人类基因组中相应的正常基因（即原癌基因）相同。这需要详细的作图和测序，最终揭示了两个等位基因版本的基因之间的区别是一个简单的点突变，正如在我的实验室发现并与Mariano Barbacid的实验室发表的并列文章中所揭示的。这些发现揭示了20世纪80年代初已经可用的重组DNA的力量。更令人兴奋的是，它们似乎表明，在一个3 × 10^9个碱基的细胞基因组中，一个单一的点突变就足以将一个正常细胞转化为一个癌细胞。因此，确实，致癌物可以创造出正常细胞基因的突变等位基因版本，一旦形成，就可以改变正常人类细胞的生物学，迫使它们变成癌细胞。
此外，编码的RAS致癌蛋白的性质已经是已知的。在某个时候，Scolnick的实验室成功地产生了针对Ki-ras编码的致癌蛋白的抗体反应。它的使用揭示了一个大约21-kDa的病毒编码基因产物。
Scolnick的小组得出结论，病毒致癌蛋白是一种鸟嘌呤核苷结合蛋白，就像当时与我们现在称为G蛋白偶联受体（GPCRs）的细胞表面受体相关联的更高分子量的异源三聚体G蛋白一样。
事实上，GPCR信号通过一个在其活性状态下结合GTP并通过其自身的内在GTPase水解GDP的信号转导蛋白的先例，是由1978年关于β-肾上腺素受体的报告提出的。
Ras蛋白作为GTP/GDP开关的想法在随后的几年迅速获得了支持。这种思考中隐含的概念是，像许多积极信号的蛋白质一样，正常的细胞稳态需要负反馈控制，这种情况下来自Ras蛋白携带的内在GTPase活性，并确保它们只激活很短的时间，使它们只发出短暂的刺激性信号脉冲——在这种情况下，是细胞内的有丝分裂信号。在随后的十年中，变得清楚的是，Ras蛋白不会自行切割它们结合的GTP。相反，Ras-GAPs，即GTP酶激活蛋白的协同作用进入了视野。
值得注意的是，对Ras-GAPs的研究导致了这样一种观念，随后得到了广泛的支持，即在各种肿瘤细胞中发现的Ras蛋白的突变形式与GAPs没有有效的相互作用，与其野生型对应物形成对比。
这些观察结果反过来导致了这样的认识：肿瘤性Ras突变的影响主要在于减弱GTPase功能，从而将突变Ras致癌蛋白长时间地困在激活的、结合GTP的状态，而不是正常、野生型蛋白所享有的短暂信号发射期。
这个简单的模型解决了1982年在HRAS基因中发现点突变最初产生的难题：与其说是破坏了RAS信号发射，不如说是最初在HRAS膀胱癌基因中发现的氨基酸替代，然后在其KRAS和NRAS同源物以及此后在成千上万个测序的人类RAS基因中发现的，只破坏了多功能RAS蛋白的一个功能——它们的GTPase活性——同时保持了它们激活下游信号伙伴的能力，通常称为RAS效应子。这样的思考也解释了为什么突变致癌蛋白在少数几个残基——12（几乎总是）、13和61——上表现出氨基酸替代，这损害了GTPase活性。
最终，这项早期对Ras致癌蛋白的工作的影响远远超出了癌症研究的范围。因此，在随后的几十年中，很明显，2亿年前真核细胞的最初发展在很大程度上依赖于一系列被称为“小G蛋白”的Ras样蛋白的进化，以与较大的异源三聚体GPCR相关蛋白形成对比。这些蛋白质的统一主题是使用自限性的、开/关信号蛋白作为调节多种细胞过程的非常有用代理，其中大多数与有丝分裂信号无关。这些过程包括调节囊泡功能、核质运输，甚至是细胞骨架重组。
鉴于上述所有情况，值得看看HRAS基因的最初工作是如何在随后的年份中得到扩展的，特别是在我们对人类癌症发病机制的理解和有效治疗的发展方面。首先，小鼠和人类肿瘤中突变ras基因的发现引发了对人类肿瘤基因组的大量分析。最初，人们希望以RAS为重点的研究与理解广泛的人类肿瘤有关。事实证明，突变RAS等位基因在某些人类肿瘤中是可证明的，如胰腺肿瘤（90%），但在其他肿瘤中很少，如乳腺癌（1%-3%）；平均而言，大约30%的人类肿瘤携带这些突变RAS致癌蛋白。这些遗传调查本身提供了几个关键的概念性见解。因此，它们表明RAS致癌蛋白可以在多种不同的分化细胞类型中起作用，而不是它们的作用仅限于一个或两个。此外，突变RAS致癌蛋白在某些肿瘤类型中的有限参与，如乳腺癌，表明很可能有功能相似或类似的致癌蛋白或转化机制在这些肿瘤中起作用。
最初的希望是RAS点突变本身足以在人体中触发肿瘤发展。然而，考虑到在人类细胞中积累的随机点突变的频率和人体中细胞的巨大数量（约3 × 10^13），很快就清楚了，许多正常成人组织必须携带数百万携带突变RAS等位基因的细胞，而不产生肿瘤。此外，1983年进行的工作表明，在原代啮齿动物细胞中，一个RAS致癌基因需要至少另一个致癌基因的协作才能引起完全的实验转化。
1989年的发现扩展了这一主题，即突变RAS等位基因伴随着许多早期结直肠癌（CRC）的形成，但在临床上可检测到的肿瘤爆发之前，必须积累多个额外的体细胞突变等位基因。
因此，当存在于许多人类肿瘤的基因组中时，突变RAS等位基因是细胞形成这些肿瘤的完全转化的必要条件，但不是充分条件。鉴于只有部分人类CRC携带突变RAS等位基因，这加强了这样一种印象，即类似功能的突变等位基因，如激活BRAF的那些，经常在形成这些肿瘤时取代RAS致癌基因，这一观点得到了两个体细胞激活等位基因在人类CRC基因组中以互斥方式存在的观察结果的强烈支持。
也许最大的失望来自于最初被接受的希望过于乐观。因此，正如许多人所认为的，包括我自己在内，理解一类人类肿瘤的形成原因，如触发RAS致癌基因形成的突变，肯定会像夜晚跟随白天一样，导致全新而有效的疗法的发展。事实上，在发现突变RAS等位基因之后，整整四十年才开发出并临床批准了一种针对RAS致癌蛋白的药物，特别是G12C突变蛋白，它在某些类型的癌症（例如，13%的非小细胞肺癌）中显著参与，而不是针对在该蛋白的第12或第13位残基上具有替代氨基酸替代的RAS致癌蛋白。事实上，正如长期以来所清楚的，没有像这一样的高度复杂的药物开发策略，RAS蛋白基本上是“不可用药的”。
事实证明，抗癌疗法的开发比我们在1982年梦想的要具有更大的挑战性。心血管研究在这些十年中显著降低了疾病死亡率，而癌症相关死亡率的最大降低来自于疾病发病率的降低，而不是一些人预期会直接从RAS研究中产生的治疗。尽管如此，即使在最初宣布半个世纪之后，抗癌战争还没有全面发动。相反，它才刚刚开始。