组织透明化是进行三维神经示踪的重要技术基础， 鼠来宝 生物精选 并翻译 一篇相关 综述， 供读者参考 。
Ueda, H.R., Ertürk, A., Chung, K. et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci 21 , 61–79 (2020). https://doi.org/10.1038/s41583-019-0250-1
组织透明化及其在神经科学中的应用 摘要 最新的组织透明化技术提供了对来自单个器官甚至某些完整哺乳动物的完整组织的亚细胞级光学观测。当与光片显微镜和自动化图像分析方法结合使用时，现有的组织透明化技术可以加快成像速度，可能将传统组织学的成本降低数个数量级。此外，组织透明化化学允许对整个器官进行抗体标记，这甚至可以应用于厚重的人类组织。通过结合最强大的标记、透明化、成像和数据分析工具，科学家们正在以加速的速度提取有关复杂哺乳动物身体和大型人类标本的结构和功能细胞及亚细胞信息。快速生成的TB级成像数据进一步创造了对高效计算方法的高需求，以应对大规模数据分析和管理中的挑战。在这篇综述中，我们讨论了组织透明化方法如何提供对哺乳动物身体和人类标本的无偏见、系统级视图，并讨论了这些方法在人类神经科学中的未来机会。
CLARITY组织透明化成像效果展示
重要词汇 组织透明化方法
组织透明化是一种使生物标本通过最小化光散射和光吸收来变得透明的技术。 疏水性组织透明化
疏水性组织透明化是三种主要的组织透明化方法之一；它使用疏水性（不与水混合）试剂。也被称为“溶剂组织透明化”。 亲水性组织透明化
亲水性组织透明化是三种主要的组织透明化方法之一；它使用亲水性（与水混合）试剂。也被称为“水性组织透明化”，但并不总是涉及水的使用。 折射率 (RI)
光在真空中的速度与在特定介质中的速度的比率。真空的RI定义为1，而水的RI约为1.33。 光片显微镜
一种技术，允许通过激光光片快速获取薄的光学切片的图像，从而对大型生物样本进行快速、高分辨率成像，同时降低光暴露。 被动CLARITY技术（PACT）
一种允许灵活的水凝胶配方和清除的技术，无需使用电泳。
组织学技术已经数十年来一直是研究组织的标准化程序；然而，要在健康和疾病中完全理解生物机制，需要对整个生物体进行无偏见的探索，而不仅仅是组织的选定部分。这种需求在神经系统的背景下尤为明显，因为神经系统遍布全身。现在，组织透明化技术允许对完整组织甚至一些完整生物体进行3D成像。实际上，一种已有百年历史的使组织透明的方法是通过近期在组织透明化试剂和流程、高效的荧光标记和快速体成像技术（光片显微镜）方面的发展而几乎被重新发明的。
目前有三种主要的组织透明化方法可用： 疏水性、亲水性 和 基于水凝胶的方法 。疏水性组织透明化和亲水性组织透明化方法也分别被称为“溶剂”和“水性”组织透明化方法。一般来说，这些组织透明化方法，特别是在高效率的流程中，通过去除脂质（脱脂）、色素（褪色）和钙磷酸盐（脱钙），并通过实现高度透明化来匹配样本和成像介质的折射率（RI）。尽管疏水性方法通常会收缩组织，从而允许成像更大的样本，但如果试剂具有低渗透压，亲水性和基于水凝胶的方法可以扩大样本（膨胀），这进一步增加了透明度和有效分辨率。 这些组织透明化方法的物理原理，以及每个组织透明化过程（即脱脂、褪色、脱钙、RI匹配和膨胀）如何促进组织透明度，正在开始通过考虑器官的物理属性来阐明。最近的一项研究已经发现，即使在没有外源性聚合物的情况下，器官也可以像聚合物凝胶一样起作用，这最初是由Tanaka及其同事通过自下而上的途径预测的。如果一个器官作为聚合物凝胶，那么器官的折射率可以根据一个称为Lorentz-Lorenz关系的理论公式，由其组分的折射率和体积来描述。因此，脱脂和脱钙会改变器官组分的折射率，从而改变器官本身的折射率，而膨胀可以增加器官组分的体积，最终也降低了器官的折射率。在任何情况下，这些过程都允许器官的折射率更容易地与介质的折射率相匹配，这导致光散射的最小化。此外，通过褪色（去除色素）器官来最小化光吸收，这也有助于样本的透明度。 最近对亲水性组织透明化试剂进行了全面的化学分析，这有助于更好地理解每个化学官能团如何促进组织透明化过程的化学原理。与深化对组织透明化方法背后原理的理解并行，研究人员正在不断改进标记和数据分析工具，以扩大组织透明化方法的应用范围。实际上，随着对整个小鼠大脑和整个小鼠身体的体外深度组织标记方法的发展，以及对中枢神经系统和周围神经系统细胞的体内系统性腺相关病毒标记的发展，标记选项已经扩展。 一旦组织被标记并变得透明，光片显微镜提供了快速的3D全脑成像，分辨率达到亚细胞水平。某些形式的光片显微镜已经能够生成各向同性和高分辨率的图像，其信噪比和分辨率显著高于双光子显微镜所能生成的图像。此外，强大的机器学习算法的发展对于优化这些大型数据集的分析至关重要，尤其是对于图像分割。这些不同学科在组织透明化方法上的汇聚将为无偏见的3D组织学评估铺平道路，这应该会大幅加速发现影响整个生物体的新的发育、生理和病理机制。 在这篇综述中，我们涵盖了迅速出现的组织透明化方法及其相关技术领域——包括标记、光片显微镜和数据分析与管理——以及组织透明化在神经科学中的应用，特别是在人类研究中的应用。然后，我们讨论了将这些技术整合以生成对人类生理学和病理学的无偏见见解的挑战和机遇。
图1 | 主要的组织透明化方法及其关键特征。 a | 疏水性方法依赖于组织的完全脱水，随后进行脂质提取和折射率(RI)匹配，使用的是一系列有机溶剂。疏水性方法通常速度快，能够彻底透明化组织。然而，某些疏水性方法可能会快速使荧光蛋白的信号褪色。b | 亲水性方法基于水溶性溶液，通常比疏水性方法具有更高的生物安全性和兼容性。一种强有力的亲水性方法，如 CUBIC ，首先进行脱色处理，随后进行去脂、折射率匹配及（可选的）组织膨胀；某些亲水性方法对于完整器官可能需要更长的孵育时间。c | 水凝胶包埋构成了组织透明化的第三大类别。水凝胶基方法要么使用单体和引发剂分子制成人造凝胶，要么使用多环氧基团制成加固的组织凝胶。水凝胶基方法可以保留足够的RNA用于诸如荧光原位杂交等检测，并且由于水凝胶网格将组织粘合，可以使组织膨胀数倍。某些水凝胶基方法对于完整器官也需要较长的孵育时间。
疏水性组织透明化 疏水性组织透明化方法涉及使用有机溶剂，通常可以快速完全透明化完整样本。例如，由Ertürk及其同事开发的3D成像溶剂透明化（3DISCO）可以在1-2天内完全透明化整个成年小鼠大脑。乙基肉桂酸酯也已被用于疏水性组织透明化，而不是有机溶剂。因为疏水性组织透明化方法简单直接，只需要将样本顺序浸泡在不同的溶液中，3DISCO及其变体已经被广泛用于神经元回路成像、炎症、干细胞和癌细胞的研究，以及未切片的啮齿动物器官和人类活检标本。基于DISCO的方法也与深度组织免疫标记方法相结合，用于研究啮齿动物胚胎、人类胚胎、癌症活检标本、成年小鼠大脑，以及最近整个小鼠身体（后面讨论）。 DISCO基于方法包括一个初始脱水步骤，去除水——组织中的主要光散射体（水的折射率为1.33，而软组织的折射率为1.44-1.56）——以及随后的有机溶剂浸泡步骤，提取大部分脂质并增加折射率以匹配生物组织的折射率（有机溶剂和收缩的大脑组织的折射率均为约1.56）。在大多数DISCO方法中（除了免疫标记启用的DISCO+（iDISCO+）），脱水导致样本显著收缩。Pan等人开发了终极DISCO（uDISCO）方法，将小鼠身体缩小到原始大小的约三分之一，这便于通过光片显微镜以细胞分辨率成像整个身体。个别器官的收缩，特别是中枢神经系统（CNS）组织，是各向同性的；骨骼也各向同性地收缩，但程度较小。通过使用uDISCO，研究人员能够在完整的CNS中可视化小鼠的神经连接性（即在大脑和脊髓中）。 有机溶剂基础透明化的一个重要优势是由于清除组织的硬化，可以永久性地保存样本。这允许多次成像检测和样本的长期重新分析，特别是通过免疫标记方法，可以永久性地稳定内源性荧光信号。尽管越来越大的样本的透明化和成像是无偏见分析组织的重要步骤，但用特定染料和抗体对大型组织进行彻底标记仍然是一个挑战。为了实现这一目标，Tessier-Lavigne、Renier和同事们首先开发了iDISCO，它实现了成年小鼠大脑的免疫标记，并允许揭示在亲代行为期间差异激活的大脑区域。iDISCO涉及使用含有H2O2和甲醇的溶液对样本进行预处理以使小鼠大脑通透化，这个过程也可能清除大部分抗体的表位。在未来，开发新的深度组织标记方法，完全保留表位，对扩大疏水性组织透明化方法的应用至关重要。 为了将免疫标记扩展到成年小鼠全身，Cai等人最近引入了vDISCO（'v'指的是重链抗体的可变域；即纳米抗体），使用高压递送纳米抗体，以在远红区域使用明亮的Atto染料进行全身免疫标记，克服了蓝绿区域许多组织的低信号强度和自发荧光。这种方法将荧光信号放大了两个数量级，从而允许成像完整透明化小鼠体内的细胞器细节，并通过骨骼和肌肉对单个细胞进行定量。vDISCO允许生成成年小鼠的首个全身神经项目组，研究中枢神经系统损伤后全身的神经退行性和炎症，以及共同发现头骨-脑膜连接，这些连接在生理和病理状态下对大脑功能至关重要。由于vDISCO即使对于解剖的器官也能极大地放大信号对比度，未来它将为基于机器学习算法的转基因标记哺乳动物大脑映射提供高质量的基准数据。
图2 | 全脑单细胞分辨率成像与分析。 a | 组织透明化方法使得全脑细胞特征描绘成为可能。所获得的大脑数据可以在三维单细胞分辨率小鼠大脑图谱（CUBIC-Atlas）中进行注册，并通过互联网由全球研究社群共享。首先，对样本应用组织透明化处理（以及适用的荧光染色）。透明化的大脑使用高分辨率光片显微镜进行成像。基于图形处理器的高速细胞计数程序从获取的图像中识别所有细胞，将整个组织渲染为细胞点的集合（即点云）。然后，将各个大脑注册到通用大脑坐标上，以便进行定量比较和分析。最后，这些数据应在研究人员之间共享，以支持协作和大规模分析。b | 使用亲水性组织透明化与膨胀协议CUBIC-X及定制的高分辨率光片显微镜获得的成年小鼠大脑图像。用碘化丙啶对透明化的大脑组织进行了核染色。展示了一些代表性脑区的放大视图，包括大脑皮层（视图1）、海马（视图2）、小脑（视图3）和丘脑（视图4），以及全脑概览。比例尺在样品膨胀标准化后表示50微米。c | 三维单细胞分辨率小鼠大脑图谱CUBIC-Atlas。利用如b部分所示的核染色图像，鉴定了整个小鼠大脑中的所有细胞核，总计约1亿个细胞。每个细胞的颜色代表了根据艾伦大脑图谱获得的各脑区的解剖注释。d | 通过成像Arc基因启动子控制下的不稳定性荧光蛋白dVenus，在给予NMDA受体抑制剂（MK-801）与否的情况下，定量全脑神经元活性概况，使用的是Arc–dVenus转基因小鼠。不同昼夜节律时间（CT）的每个Arc–dVenus小鼠大脑以概率方式映射到CUBIC-Atlas上，虚拟重建时间序列。表达Arc–dVenus的细胞以点的形式显示，其颜色代表它们的解剖区域。e | 对d部分所示数据进行聚类分析，鉴定了四个不同的细胞群体，它们在MK-801给药时表现出不同的活性模式。每个群集的定位显示在冠状切片上，揭示了下部和上部齿状回中细胞种群的不均匀性。b至e部分改编自参考文献17，Springer Nature Limited。
亲水性组织透明化 亲水性组织透明化方法使用水溶性试剂进行组织透明化。尽管亲水性组织透明化方法的透明化性能有时不如疏水性组织透明化方法，但前者具有明显的优势，包括高度的生物相容性、生物安全性和蛋白质功能保护。亲水性试剂通常与组织成分（如蛋白质）以及周围水分子形成氢键，这有助于保持组织成分的3D结构，从而保持荧光蛋白的信号。此外，亲水性试剂可以高浓度溶解在水中，并可用作折射率匹配介质，以在介质中提供高折射率。亲水性组织透明化方法也有着大约四分之一世纪的悠久历史（自1995年以来；框1）。 Chiang和同事是最早将亲水性组织透明化应用于神经科学的研究者之一。他们开发了FocusClear，其中包括一个X射线对比剂（例如，地特拉唑酸）和一种洗涤剂（例如，Tween 20），并将其应用于整个蜚蠊大脑的成像。Miyawaki和同事最近开发了Scale，它包含尿素作为关键的组织透明化成分，可以通过超水合来膨胀生物样本——例如，整个小鼠胚胎（胚胎日13.5）、幼鼠大脑（出生后第15天）和成年小鼠大脑切片（7-13周大），从而降低它们的折射率。与大多数疏水性组织透明化试剂相比，Scale可以更有效地保护荧光蛋白。该方法允许成像标记有黄色荧光蛋白的Thy1表达神经元的幼年和成年小鼠，成年小鼠海马体中的绿色荧光蛋白标记的神经干细胞，以及通过检测Fucci-S/G2/M和Fucci-G1/G0标记物来了解小鼠胚胎的细胞周期状态。研究人员进一步通过将尿素与山梨糖醇结合开发了Scale，以开发ScaleS，可以应用于成年、老年和疾病小鼠的大脑半球。Imai和同事开发了See Deep Brain（SeeDB）流程，使用果糖作为其关键的折射率匹配组分，用它来追踪小鼠嗅觉球中的神经回路，因为它不会膨胀或收缩生物样本，因此保留了它们的形态。他们通过使用具有更高折射率的X射线对比剂进一步完善了这种方法，导致了SeeDB2流程的开发，该流程已应用于小鼠大脑中神经回路的超分辨率成像。 Ueda和同事采取系统级方法来鉴定有效的亲水性组织透明化试剂，通过全面化学分析。他们发现了一系列的氨基醇，既有脱脂也有褪色能力，然后开发了一系列用于脱脂和褪色的清晰、无障碍大脑或身体成像鸡尾酒和计算分析（CUBIC）试剂。通过分析1600多种亲水性化学物质，他们还发现了一系列的芳香酰胺，可以用作有效的折射率匹配试剂。通过结合最先进的脱脂（CUBIC-L，其中“L”代表“脱脂”）和折射率匹配（CUBIC-R+，其中“R”代表“折射率匹配”，“+”表示通过添加氨基醇N-丁基二乙胺来实现基本条件）试剂，亲水性方法的组织透明化性能现在类似于或甚至可以超过疏水性方法，而不失其生物相容性、生物安全性和蛋白质功能（例如，荧光）保护的优势。CUBIC已被应用于光暴露和药物给药诱导的全脑成像早期即刻基因表达，全脑成像癌症转移，全脑成像单个神经元和味觉感觉回路的小鼠大脑，以及3D大脑成像谷氨酸能突触连接、下丘脑神经亚型、层特异性星形胶质细胞形态和视网膜神经节细胞的视觉投射。CUBIC还应用于其他器官的3D成像，包括骨髓中的造血干细胞、肺癌中的癌细胞以及乳腺中的单细胞谱系追踪和心脏的发育。因此，这些器官中的周围神经系统可以详细分析。 一些亲水性组织透明化方法中的脱脂为大分子如抗体更快更深入地穿透组织创造了空间，允许在大样本中进行3D免疫组织化学。CUBIC已成功用于成年小鼠大脑、心脏、肺、胃和肠道的3D免疫组织化学。最近，CUBIC-L和CUBIC-R与全脑3D免疫组织化学相结合，用于成像整个小鼠大脑中的血管。CUBIC还被应用于3D免疫组织化学和成像表达囊泡乙酰胆碱转运体的神经元，这些神经元支配胰腺中的胰岛。除了由于脱脂而增强的抗体渗透之外，减弱抗体与组织之间的相互作用似乎也可以加速抗体进入组织。例如，AbScale流程使用蛋白质变性剂尿素进行抗体染色，实现了成年小鼠大脑半球的3D免疫组织化学。原始的Scale流程使用尿素进行组织透明化，而不是用于抗体染色。AbScale与大脑广泛免疫组织化学一起使用，以在小鼠中成像淀粉样β斑块，这是阿尔茨海默病的一个标志性病理特征。 亲水性方法也可以扩展到膨胀显微成像技术（expansion microscopy ） 。例如，涉及使用咪唑和抗环 血酸 作为超水合试剂的CUBIC-X流程可以将成年小鼠大脑扩大10倍体积（CUBIC-X中的“X”代表“X倍扩展”）。使用CUBIC-X流程允许对成年小鼠大脑进行全脑细胞分析，并允许开发3D单细胞分辨率的小鼠大脑图谱（CUBIC-Atlas），其中包含整个大脑的约10亿个细胞（图2）。这样的大脑图谱可以成为广泛使用的平台，用于绘制细胞活动（例如，即刻早期基因的表达）、细胞类型（例如，特定亚型的神经元和胶质细胞）和神经连接体（例如，通过腺相关病毒和/或狂犬病病毒绘制神经连接）。
基于水凝胶的组织透明化 为了扩大组织透明化技术的应用范围，Deisseroth、Chung和同事们引入了一种名为“清晰化脂质提取丙烯酸杂交刚性免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶”（CLARITY）的水凝胶基组织透明化方法，该方法通过将分子共价结合到基于丙烯酸的水凝胶中，在其生理位置上固定了广泛的生物分子。这种独特的水凝胶加固允许在最小化结构损伤和生物分子丢失（CLARITY中蛋白质丢失10%，而仅甲醛固定的组织中蛋白质丢失70%）的同时，完全均匀地去除组织中的脂质。在CLARITY中，电泳驱动和简单被动清除都可以有效地去除脂质，这显著增加了水凝胶-组织混合物的光学透明度和大分子渗透性。清除后的完整器官可以通过荧光显微镜成像，而不会失去分辨率。小组织可以很容易地用分子探针（如抗体）染色；然而，大组织的染色需要更长的孵化时间，就像所有依赖被动扩散的组织处理方法一样。
图3 | sHieLD-MAP系统与基于AAV的标记系统。 SHIELD（系统级控制化学物质作用时间和动力学）结合MAP（蛋白质组的放大分析），实现了单细胞分辨率下的整合电路映射。a | sHieLD-MAP流程。SHIELD通过同时保护透明化组织内部的分子和结构信息，允许对同一小鼠大脑中荧光蛋白标记的回路、mRNA和蛋白质进行全面的多尺度成像。b | 图像显示了外侧苍白球（GPe）中帕瓦氏蛋白（PV）阳性神经元的荧光蛋白标记神经回路的3D渲染，叠加了单一标记神经元的轴突追踪。插图展示了多轮染色和多尺度成像的示例图像。插图的比例尺为50微米。c | 重建的神经元及其下游目标的轴突树突分支。每个圆圈代表一个神经元，圆圈内标记了推测的轴突体突触节数量。每个圆圈的颜色提供了每个神经元的分子细节。d | 重建的针对“细胞D”（c部分中橙色高亮的细胞）推测的轴突体突触连接。分枝轴突（灰色）和增强绿色荧光蛋白（eGFP）阳性的突触前芽（蓝色）被分割。比例尺为20微米。e | 病毒辅助的光谱追踪（VAST）可用于标记和可视化厚且透明的组织块中细胞的3D形态和连接性。这里，示意图展示了两部分组成的VAST标记系统。高剂量的三载体鸡尾酒（分别表达红色、绿色或蓝色荧光蛋白）与可变剂量的诱导载体共施用，后者是激活三种蛋白表达所必需的。为了标记特定的细胞群体，荧光蛋白的表达也可以设置为依赖于 Cre 重组酶。f | 鼻嗅球的投影图像，其中颗粒细胞通过VAST标记（左）。这些细胞的稀疏标记允许追踪它们的树突分支（中）。右侧图像显示了追踪与投影图像的叠加。AAV，腺相关病毒；CR，钙结合蛋白；FISH，荧光原位杂交；hSyn1，人突触素1基因启动子；IHC，免疫组织化学；GPi，内侧苍白球；nRT，丘脑网状核；SNr，黑质网状部；STN，丘脑下核；WPRE，地松鼠肝炎病毒转录后调控元件。a-d部分改编自参考文献71，Springer Nature Limited。e和f部分改编自参考文献80，Springer Nature Limited。 CLARITY技术的多种变体已经被开发出来，目的是通过降低凝胶密度和交联程度来增加组织的通透性和探针渗透能力，例如被动CLARITY技术（PACT）。然而，减弱凝胶架构会导致组织信息的丢失。为了在不损害组织完整性的情况下加速分子标记，开发了一种新的分子输运模式，称为“随机电输运”。随机电输运产生了一种电泳驱动的扩散随机运动，使广泛的分子（例如抗体、染料和洗涤剂）迅速进入致密的组织凝胶中，它使得完整的小鼠器官在2到3天内就能实现均匀透明化和染色（相比之下，依赖这些分子被动扩散的方法则需要数周到数月的时间）。 丙烯酸基凝胶的物理化学性质可以被设计以向组织-凝胶混合体添加功能。Boyden及其同事将组织与可膨胀的水凝胶杂交，然后使用蛋白酶消化蛋白质，以实现各向同性膨胀，进行超分辨率成像。Chung及其同事开发了一种称为“蛋白质组的放大分析”(MAP)的技术，省去了上述的蛋白消化步骤，从而在保持完整器官的3D蛋白质组的同时实现各向同性膨胀。在MAP中，首先在原位合成高度密集的水凝胶，然后使蛋白复合物解离，以实现器官水平上的3D蛋白质组的各向同性膨胀。作者展示了该技术在超分辨率成像和神经投射重建方面的独特实用性。为了更好地检测RNA，最近的一项研究使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺化学方法将RNA锚定到聚丙烯酰胺凝胶上。 这些技术进步使得能够在亚细胞分辨率下实现全脑范围内的生物分子空间映射。然而，许多组织透明化方法中使用的苛刻化学处理，如洗涤剂和有机溶剂处理，有时会导致组织损伤。为了解决这一局限性，开发了一种名为“通过分子内环氧键防止降解以稳定恶劣条件”(SHIELD)的方法，用于在器官尺度的透明组织中保存蛋白质、蛋白抗原性、转录本和组织结构。SHIELD使用聚环氧化学品通过形成分子内和分子间交联来保护生物分子的物理化学性质（例如，蛋白质荧光和抗原性）。为了在器官尺度的组织中实现均匀和可控的交联，首先将聚环氧化学品分散在一种称为“系统级控制化学物质作用时间和动力学（SWITCH）-关闭缓冲液”中，该缓冲液能抑制固定反应。一旦交联剂均匀分散，通过将样本转移到增强固定反应的SWITCH-开启缓冲液中，即可全局开启反应。这一简单策略允许规模化和均匀地保存蛋白质荧光、转录本和蛋白质。经过SHIELD保存和脱脂的组织能够承受苛刻的抗体脱色条件，因此允许对同一样本进行多轮染色和成像。使用SHIELD，研究者展示了在单细胞分辨率下对神经回路及其下游靶标的综合映射，以及仅在几小时内对完整针吸活检样本进行3D分子表型分析（图3）。此外，这些技术还使得能够研究大脑类器官的3D结构以及网络特异性淀粉样蛋白进展。 基于水凝胶的方法进一步适用于全身尺度。Gradinaru及其同事开发了原位灌注辅助试剂释放(PARS)，使啮齿动物的身体透明，从而获得靶器官处中枢和周围神经的地图。Gradinaru及其同事意识到循环系统（血管系统）可以用来输送透明化剂和标记物，而不是依赖于对大器官或整个生物体来说过于缓慢的被动扩散。基于CLARITY的方法可适应于骨骼，以及在保留荧光标记的同时实现放大单细胞可视化（参见参考文献9中的补充图4）。 综上所述，这些技术革新不仅极大地推进了对大脑内部复杂结构的理解，也为研究整体生物体的三维组织结构、疾病进展以及药物筛选等领域提供了强大的工具。通过不断优化和创新，未来的研究有望在更精细的层次上解析生命科学的奥秘。
标记 为了使CLARITY和其他组织透明化方法发挥其最大潜力，将死后样本数据与功能性标记物相结合将是至关重要的。我们无法在保持大脑存活的同时去除脂质，但至少可以通过转录或生化变化（例如，Ca2+内流）来短期储存“神经活动记忆”，这些变化可在死后和全脑范围内进行评估。大脑回路中的活动历史也可以通过蛋白质表达的变化来报告。如前所述，疏水性、亲水性和水凝胶基组织透明化方法均与完整器官的抗体染色兼容。大脑活动的遗留也通过RNA转录本的变化来报告，这些变化可以通过单分子荧光原位杂交检测，并确实保留在PACT透明化的组织中。更广泛地说，维持组织的空间关系，同时访问选定细胞的转录组，对于生物学的许多领域都是极其重要的兴趣所在，这也促成了深部组织中多色彩、多RNA成像方法的发展。利用单分子杂交链反应、组织水凝胶包埋、PACT透明化处理以及光片显微镜技术，可以实现对大约毫米厚度脑切片中单分子mRNA的检测。通过在PACT透明化样本中进行rRNA标记，研究人员绘制了囊性纤维化患者痰液样本中病原体的身份和生长速率图谱。 组织透明化方法在追踪中枢神经系统(CNS)和周围神经系统中的长程投射方面特别有用。然而，为了最大限度地发挥它们的影响，透明化方法需要与标记方法相辅相成，例如，能以强烈的、填充形态的标记突显所需的神经回路，同时保留其遗传身份，并且易于使用和高度可定制（即，它们尽量减少生成或交叉转基因动物的需要）。这一点已被很好地应用于研究小鼠大脑中多巴胺能投射的地形学。由于在密集标记神经元的数据集中进行形态重建较为困难，因此能够容易控制被标记细胞的比例将是理想的。利用最近工程化的系统性腺相关病毒的力量，这些病毒能够穿过血脑屏障，在这方面是有益的，并且现在已有方法可以使用多种病毒载体表达的遗传编码荧光蛋白，以广泛的色调标记大脑、周围神经系统和其他器官中的单个细胞。病毒辅助的光谱追踪是一种高度可定制的多色彩标记系统，具有可控的标记密度，允许对完整、厚实、透明的组织样本中细胞的三维形态进行详细研究（图3）。基于基因递送的标记方法的独特优势在于，除了提供形态标记外，还可以引入改变细胞状态的基因，并在同一研究对象中评估状态改变和未改变细胞的形态效应；结合组织透明化技术，这将极大地增进我们对生理学和病理学的理解。 应用于人类 我们对人类身体的了解主要是宏观的，基于几个世纪前建立的经典解剖方法，这些方法需要解剖和切片个别器官，如大脑。然而，最近的研究表明，组织透明化和光片显微镜正在开始彻底改变对实验动物的研究，以及对人类解剖学和疾病诊断的研究。组织透明化的创新浪潮主要来自神经生物学家，他们面临着一个艰巨的任务：解码人类连接组。神经系统是迄今为止最复杂的器官，可能包含数百种不同的细胞类型，形成复杂的电路和网络，其组织方式从2D切片中极难理解。组织透明化和光片显微镜的结合已经允许我们成像整个小鼠大脑和脊髓，并更好地理解某些动物模型中的中枢神经系统退化的程度。CUBIC方法已经与受激发射损耗显微镜结合使用，以更好地可视化小鼠皮层中锥体神经元树突棘上的突触接触。下一个挑战是将这些知识转化为对人类神经系统的分析，并开发应用程序以改善大脑疾病的死后病理评估。
图4 | 逐步构建三维的发育中人类细胞图谱。 溶剂型组织透明化特别适用于人类胚胎的分析，因为它能够使大型且完整的样本中免疫标记细胞的可视化和映射成为可能。这为观察发育中的器官和人体细胞提供了前所未有的视角。a-d | 8周妊娠期人类胚胎的周围神经（a部分）、泌尿生殖系统的苗勒氏管和沃尔夫氏管及肾脏（b部分）、背部、手臂和头部的肌肉（c部分）以及手部的血管系统（d部分）。e、f | 9.5周妊娠期胎儿的手部三大感觉神经（e部分）和肺上皮小管（f部分）。a、b、d-f部分经许可改编自参考文献23，Elsevier出版。c部分经许可改编自参考文献165，Company of Biologists，doi:10.1242/dev.180349。 基于CLARITY的透明化程序已经允许在健康人脑样本中成功成像皮层锥体神经元和中间神经元以及小脑的Purkinje细胞和颗粒细胞。这些程序还允许成像病理性人脑样本，包括可视化自闭症个体的组织、帕金森病中的α-突触核蛋白包涵体、多巴胺轴突和黑质，以及小脑共济失调中的Purkinje细胞、线粒体和血管，以及阿尔茨海默病中的淀粉斑。其他大脑透明化技术，如iDISCO和ScaleS，也已经在阿尔茨海默病脑样本上进行了尝试；尽管这些研究只是确认性的，但它们为微胶质细胞与淀粉斑之间的关联提供了更直接的证据，这些技术还促进了弥漫性斑块的检测。CUBIC已经在癌症转移的全脑免疫组织化学中使用。此外，在用2,2'-硫代二乙醇清除的脑半球切片中成像了GABAergic中间神经元，以及在用ACT-PRESTORE（活性清晰技术-压力相关的高效和稳定的大分子器官转移）清除的脊髓片段中成像了神经元和血管。与亲脂性染料兼容的透明化试剂OPTIClear已被用于标记成年人类小脑中的苔藓纤维轴突。 上述研究提供了人类大脑透明化的可行性证明，并支持了这种方法的可行性，但这些和其他研究揭示了当前人类透明化方法的技术局限性。首先，透明化在相对薄的大脑切片或块上是有效的，其体积不超过几百立方微米，最多相当于人脑总体积的1/1,500。良好的透明性有时需要延长透明化时间，与啮齿动物的几天相比。其次，甲醛固定的人类脑组织高度自发荧光，富含血液，含有脂褐素型色素和神经黑色素，这些都很难清除。第三，免疫染色只在厚度小于几百微米的样本上成功，许多抗体在组织透明化处理后无法工作。使用单链可变片段的常规抗体或纳米抗体可能是提高大脑样本渗透性的好选择。因此，尽管到目前为止的进展是有希望的，但常规的死后3D成像整个人类大脑仍然遥不可及，仍然是一个诱人的挑战。透明化方法的可扩展性将是至关重要的，还需要开发具有更长工作距离和更大视野的光片显微镜。基于溶剂的透明化方法可能会被优先选择，因为它们可以显著减少样本体积。一旦优化，人类大脑透明化将是相关和验证通过MRI和扩散张量成像获得的活体3D数据的独特工具。这将是改善疾病诊断所必需的。 虽然透明化的成年人类中枢神经系统的3D成像仍处于起步阶段，但组织透明化已经为人类胚胎学领域提供了大量新信息，并允许轻松观测毫米级大小的大脑类器官的3D细胞结构。基于溶剂的DISCO透明化方法非常适合于人类胚胎和胎儿的透明化，至少在3个月的妊娠期之前。此外，使用这种方法，对厘米大小的人类标本进行了全切片免疫标记，使用了大量抗体面板（图4），并指示了运动和感觉轴突如何侵入手、四肢、头部和各种器官，并揭示了感觉神经分支模式的意外异质性和随机性。DISCO清除的人类胚胎的3D成像也展示了分泌促性腺激素释放激素的神经元沿着两条独立的路径迁移并殖民下丘脑之外的许多大脑区域。使用CLARITY描述了胚胎胰腺的神经支配。现在，我们可以重新审视胚胎学，并设想构建人类发展的全面3D地图集。实际上，组织透明化将对人类发展细胞图谱项目（Human Developmental Cell Atlas project）非常有价值，这是人类细胞图谱（Human Cell Atlas）的一个组成部分，这是一个旨在识别和绘制人体所有细胞的国际倡议。 了解肿瘤细胞和病毒如何在体内增殖和传播是肿瘤学和病毒学中的重大问题，并且它们在神经科学中的关注度越来越高，因为神经系统和免疫系统之间存在紧密的相互作用。组织透明化方法的最近应用已经帮助以前所未有的分辨率追踪了HIV感染的人T淋巴细胞在小鼠淋巴器官中的传播和人类癌细胞系在完全清除的小鼠中的传播。这些研究已经证明，在透明化器官中的细胞分辨率明显优于经典肿瘤检测方法（如生物发光）所达到的分辨率。已经描述了清除的人类肿瘤活检样本的细胞组成。因此，一旦被组织病理学家采用，组织透明化有望迅速改善在其原生环境中肿瘤细胞生态位的分析、肿瘤的诊断、分期以及抗癌和抗病毒治疗的验证。
光片显微镜
为了充分利用前面讨论的透明化方法，并系统地在亚细胞水平提取结构信息，透明化方法需要能够对大体积进行快速、高分辨率成像的显微镜。为此，已经开发或改进了一些强大的成像方法。其中一些努力集中在将现有的、成熟的技术（如双光子显微镜）推向其性能极限。值得注意的是，Chandrashekar、Myers和同事们开发了一个完整的成像框架，将快速的共振扫描双光子显微镜与组织振动刀集成在一起，以促进整个小鼠大脑的高空间分辨率成像。他们实现了0.45微米横向和1.33微米轴向的空间分辨率，数据采集速率为每秒1.6×10^6微米^3，这允许完全自动化地在大约一周内获取整个小鼠大脑。为了进一步提高速度和分辨率，正在进行的努力正在利用新兴的成像策略。光片显微镜是实现这一目标的关键方法，因为它在空间和时间分辨率上都承诺了显著的性能提升。 光片显微镜的核心思想是用一束激光光从侧面照射样本，并用基于相机的检测系统获取被照射平面的图像。在光片显微镜的最常见实现中，宽场检测臂垂直于光片照明轴，使用单独的物镜进行照明和检测。与传统显微镜相比，这种方法为大组织体积的成像提供了两个主要优势。首先，成像速度仅受相机的采集速率限制，因此可以使用现有的科学级CMOS（sCMOS）探测器实现高达数亿个体素每秒的异常高数据速率。其次，由于只有检测系统的焦平面被激光光照射，因此光漂白和光毒性效应被保持在最低限度。样本的任何部分所暴露的能量是恒定的，与样本的总大小或成像体积无关。相比之下，使用同一物镜进行照明和检测的常规或共焦显微镜，在成像过程中也会照射到焦平面之外的区域（上下焦平面）。在这些方法中，局部光暴露量随着成像体积的增加而线性增加，甚至可能导致在体积采集完成之前标本的某些部分完全漂白。
图5 | 定制与商业光源显微镜的分辨率与速度。 a | 自定义（红色）和商业（绿色）光源显微镜以及最先进的双光子显微镜（蓝色）的横向与轴向系统分辨率。系统分辨率值代表了每项研究中演示实验所报告的光学配置和光源特性。量化忽略了与选择检测器固有空间采样限制相关的因素。分辨率值以系统点扩散函数的半高全宽（FWHM）大小给出。晶格光源（LLS）显微技术采用两种不同的采集模式（抖动光源与结构照明(SI)），这影响了速度和分辨率。b | 商业光源显微镜（绿色）和使用自定义光源（黑色）及双光子（蓝色）显微镜进行成像实验的采样受限3D分辨率与体积吞吐量的关系。3D分辨率定义为dd_lat^2_ax，其中d_lat是采样受限的横向FWHM尺寸，d_ax是采样受限的轴向FWHM尺寸的点扩散函数。横向采样可以通过改变检测系统的放大率来调整，这通常会影响体积吞吐量和有效分辨率（例如，LaVision BioTec超显微镜的×1.26与×12.6放大设置，或IsoView的×16与×32放大设置）。自定义光源和双光子显微镜的数据点涉及海马树突、秀丽隐杆线虫发育、细胞动态、斑马鱼神经系统和小鼠大脑的成像。商业显微镜的数据点反映了制造商提供的技术规格。图中包含的所有技术都已成功应用于透明化组织的成像。c | a和b部分所示方法的检测系统的作业距离。Economo等人的设计不需要长工作距离光学元件来成像小鼠大脑，因为他们的显微镜与组织振动切片机集成。Chhetri等人用四个相同的物镜包围样品，用于照明和荧光检测，这在特殊情况下（成像透明、透明化的组织）可使双向工作距离增加一倍（与单一物镜的原始工作距离相比）。原则上，通过将样品旋转180°并从相反视角采集体积数据，其他光源技术的最大支持样品尺寸也可以加倍，但这会牺牲时间分辨率。Tomer等人建议利用检测物镜大部分的工作距离，在检测路径中引入高折射率材料块。因此，有效工作距离（块与样品聚焦区域之间的距离）通常不等于物镜的原始工作距离。出于这个原因，这项技术没有包含在此图中。
在本世纪初现代光片显微镜重生后不久，Dodt和同事们在2007年首次将其应用于透明化组织的成像。为了快速获取来自荧光标记的切除海马体甚至整个胚胎小鼠大脑的体积图像数据，他们开发了一种具有低放大倍数、长工作距离检测光学和两个相对照明臂的光片显微镜。这种方法提供了轴向上几个微米的分辨率，横向上略小于1微米的分辨率（图5）。自第一份报告以来，许多其他研究也使用光片成像进行了概念上类似的实验。最初的努力完全依赖于定制构建的系统，但不久之后，第一批商业产品问世，如LaVision BioTec的ultramicroscope。这些显微镜很快就与各种透明化方法和广泛的生物样本兼容，包括各种器官、整个大鼠大脑、鸡胚、人类胚胎甚至整个成年小鼠。 光片显微镜中的成像速度通常受相机帧率的限制，大多数方法使用类似的光学和类似的静态或扫描光片。因此，迄今为止开发和使用的所有系统中都实现了可比的空间和时间分辨率。然而，在过去几年中，新的方法在光片显微镜设计用于活体成像应用时，允许在空间分辨率上取得基本进步。当成像相对较大的视场时，标准光片显微镜中的分辨率沿检测轴方向通常较低——通常至少为几个微米。这种限制源于由常规光束整形技术生成的相对厚的光片。相比之下，使用贝塞尔光束或格点光片——这是传统高斯光束的替代品——现在可以实现大约几百纳米的高空间各向同性分辨率，这些光束允许照射标本的异常薄截面。此外，通过将光片显微镜与多视图成像概念相结合，也实现了300-400纳米的所有空间方向上的高分辨率。多视图成像背后的关键是，通过从两个正交视图成像相同的样本，可以交换分辨率低和高的方向。当通过图像处理将这些视图的互补信息结合起来时，因此可以在给定样本视图中观察到的低轴向分辨率可以简单地被第二个垂直视图提供的更高横向分辨率所取代。这种多视图成像的概念，如在diSPIM和IsoView光片显微镜中实现的那样，是实现高分辨率成像的有希望的候选者，因为它可以在提供高空间分辨率的同时，在大视场下实现高体积采集速率。例如，在IsoView显微镜中，该概念允许在每秒超过10^8微米^3的体积通量下实现400纳米的各向同性空间分辨率，同时提供成像大型标本所需的长工作距离，而无需物理切割（图5）。无论选择哪种显微镜实现方式，成像大型样本还受益于自动化策略和计算技术，这些技术可以调整显微镜以适应样本的光学特性。尽管透明化样本的透明度异常高，但RI中的剩余空间变异性或样本与成像介质的RI之间的小不匹配可能会在光片照明和荧光检测中扰动光路。为了确保在整个样本体积中光片与检测焦平面之间的最佳重叠——从而实现最佳分辨率、对比度和信号强度——已经开发了自适应成像和自动对焦技术，这些技术在概念上与大多数现有的光片显微镜设计兼容。 当成像非常大的样本，如毫米甚至厘米范围时，重要的是要注意，即使是具有相对大视场的技术通常也不能将整个样本适应到它们的原生成像体积中。这些限制源于在设计常规光学元件时视场大小和数值孔径（因此分辨率）之间的基本权衡，与高端数字相机的属性相关的限制，以及与在大视场下创建足够薄的光片相关的挑战。因此，现有方法中对大型样本进行高分辨率成像的典型解决方案，如格子光片显微镜或IsoView光片显微镜，是依赖于平铺策略来成像大至整个透明化和/或扩展的神经系统的样本。这种方法在很大程度上将样本大小与空间分辨率解耦，允许最先进的显微镜无论用于成像单个细胞还是整个大脑，都能产生最佳质量的图像（假设组织透明化方法的性能良好）。这种方法的两个缺点是，由于光学平铺的顺序性质，数据吞吐量有限，以及需要复杂的计算方法进行图像处理。因此，正在进行的研究工作正在探索这些瓶颈的其他可能解决方案，包括开发轴向扫描光片显微镜和用于生成光片的替代光学策略。 未来，我们预计将看到强大的新型光片显微镜实现，这些实现结合了最新的高速、高分辨率成像突破，以及由几家主要光学公司专门为成像大型透明化组织而开发的新型大孔径、长工作距离检测光学。此外，通过追求多路复用策略，可以并行化整个大型组织体积的成像过程，进一步实现成像速度的提升。 数据分析与管理 随着强大的显微镜的出现，它们允许对大型样本进行高速、高分辨率成像，因此需要新的计算方法来应对大规模数据分析和管理方面的下游挑战。例如，使用高分辨率光片显微镜获得的单个小鼠大脑的原始记录通常包含数千个单独的3D子体积（也称为“平铺”），以及数十TB的图像数据。图像采集的平铺通常是必要的，因为光学显微镜的视场有限，对于像小鼠大脑这样大的样本，只能一次捕获样本体积的一小部分。因此，需要对样本或光学元件进行平移，顺序采集多个子体积，最终获得整个样本的图像。为了有效地存储、处理并从生成的图像数据中提取生物学意义，需要强大的计算方法来促进以下方面：大规模数据管理；多平铺图像配准和融合；图像分析和将图像数据映射到现有的大脑图谱；以及3D图像数据的可视化和交互式查看。这些挑战的每一个都是该领域正在进行的工作的焦点，现在已有一系列有用的计算工具可用。 在数据管理领域，最近的努力导致了几种文件格式的创建，这些文件格式旨在促进大规模光显微镜图像数据的快速压缩和解压缩。 KLB 文件格式是基于块的、无损压缩格式，提供类似 JPEG2000 的压缩因子，同时将写入和读取速度提高五倍（分别高达500 MB/s和1000 MB/s）。基于块的实现还提供了对大型多维图像中局部区域的快速观测。KLB支持在基于块的容器中集成其他压缩算法，并且只需要CPU，因此允许在廉价的低端计算机上有效部署。通过将KLB与背景掩蔽相结合，实现了数据大小减少30倍到500倍。同样，BigDataViewer Fiji插件利用ImageJ生态系统的基础架构，即ImgLib2库，提供对各种基于块的数据格式的无缝访问，包括KLB、层次数据格式版本5（HDF5）、Imaris和CATMAID（用于大量图像数据的协作注释工具包）。此外，它提供了一个强大的缓存方案，确保数据被最优地传输。当与HDF5容器结合使用时，例如在光片显微镜数据的多视图重建中，BigDataViewer允许与任意压缩方案的直接结合。依靠ImgLib2，它被设计为独立于数据类型（8位、16位、RGB等）、维度（1D到nD）和存储策略（内存、本地或远程文件系统）来高效地编写图像分析算法，使得通过BigDataViewer在几乎无限的数据上部署复杂的图像处理流程成为可能。B3D格式提供了一种补充方法，使用基于图形处理单元的计算统一设备架构（CUDA）处理，进行高性能数据压缩。虽然B3D不使用基于块的架构，但它提供了大约每秒1000 MB的优秀读写速度，并包括无损和有损压缩方案。通过使用图像中编码信息的替代表示，也可以实现存储需求的减少和图像数据计算处理的速度提升。例如，自适应粒子表示根据局部信息内容进行自适应重采样，并使用局部增益控制存储信息，将信息存储为一组具有相关强度值的粒子单元。自适应粒子表示的开发者表明，这种表示不仅可以促进数据压缩，而且还有可能加快后续图像处理步骤，如过滤或图像分割。挑战将在于将现有的图像处理解决方案适应这种新的数据表示范式。 将大型透明样本的原始图像数据转换为空间上连贯、高分辨率的图像体积，适用于数据可视化和分析，涉及几个关键步骤。需要精确对齐和融合各个图像平铺，如果使用光学显微镜记录了样本的互补视图，则可能需要额外的多视图去卷积步骤。BigStitcher是一种可扩展且高效的软件，适用于处理大型样本的TB级图像数据，如整个哺乳动物大脑或整个无脊椎动物神经系统。该工具利用了ImgLib2和BigDataViewer的强大功能，并且作为广泛使用的图像处理软件包Fiji的插件方便地可用。一旦这些初始图像处理步骤完成，并且重建了完整样本的高质量图像体积，下游分析和数据挖掘通常涉及将图像数据与解剖参考图谱进行映射和比较、图像分割、注释图像数据以及交互式数据可视化。对于图像体积的映射或与共同解剖图谱的比较，已经开发了几种工具，但它们目前无法处理非常大的数据体积。BigWarp允许手动、交互式、基于地标的可变形图像对齐，适用于任意大的图像，因为它使用BigDataViewer进行可视化和导航，并在Java中实现了基于点对应物的薄板样条变形。对于图像分割，基于机器学习的强大图像分析方法正在迅速获得动力。iLastik工具包已被广泛采用为交互式图像分类和分割的友好框架，具有直观的图形用户界面。使用此工具包不需要熟悉机器学习算法或图像处理专业知识，因为用户只需通过标记图像数据的一小部分来与软件通信，从而直观地指示所需的分类方案。iLastik然后从这些用户提供的标签中学习，以构建适合于自动化处理大型数据集的分类器。实时反馈还允许用户迭代细化分割结果并更新相应的分类器。 其他软件工具支持在小鼠大脑中研究结构与功能的关系。例如，一个开源框架由包含WholeBrain和OpenBrainMap的软件包组成，可实现对解剖学、分子和功能光镜图像数据集的整合。该框架使用来自Allen研究所生成的小鼠参考分形[136]中的信息和定义，并包括将标记神经元投射到灵活、标准化的大脑分区图的映射工具；用于统计数据分析的数据可视化和共享通过交互式网络界面进行。CATMAID是另一个有用的软件框架，它提供了对大规模电子显微镜和光学显微镜图像数据集的高效访问，并通过分散式的web接口提供对这些数据进行协作注释的基础设施。这些设计原则不仅使计算神经科学的应用成为可能，尤其是连接组学领域中的应用，而且也为生命科学领域的大型项目奠定了基础，如发育生物学中对整个组织细胞的跟踪。最后，专门针对需要对大型图像进行交互式三维可视化而设计的方法为处理大型样本的高分辨率图像的开源工具套件添加了另一个重要方面。BigDataViewer和TeraFly可以实现对大容量图像堆栈的三维查看，并且能够对图像样本的坐标系（如平移、旋转和缩放）做出非常灵敏的反应。BigDataViewer集成于Fiji生态系统中，对于手动分割和跟踪多视图全光学切片显微术数据中的细胞等高级软件包（如BigStitcher、BigWarp和MaMuT）起到核心作用。TeraFly以一种特别节省内存的方式构建，并提供真正的三维渲染能力，如实时Alpha混合，以及一个“虚拟手指”功能，可以将用户从计算机屏幕的二维平面输入映射到数据集中选定的生物结构的三维位置。 未来目标 传统的组织学通常只在少数选定的薄片上进行。然而，对选定的组织切片的分析往往容易受到不可避免的偏见，因为可能会错过位于其他地方的重要生物医学信息。相比之下，在完整的透明标本上进行三维组织学提供了更多的信息，并因此可以更深入地了解解剖学和病理学。此外，与传统组织学方法相比，它可以将组织学的速度提高数万倍，降低成本。 尽管组织去透明化方法的效果已经显著提高，但我们仍然缺乏对组织去透明化过程背后的物理化学原理的严格理解。此外，我们还需要更强大的标记、成像和数据分析工具来扩大组织去透明化方法的应用范围。具体来说，我们需要以下这些：用于啮齿动物和灵长类动物的整个器官、大型人类组织甚至整个成年啮齿动物和灵长类动物身体的快速且均匀的蛋白质和RNA标记方法；能够成像大尺寸组织的光片显微镜。 具有各向同性亚细胞分辨率（小于1微米）的成年啮齿动物和灵长类动物的器官和身体；以及用于大于数太字节的数据集的拼接、地图注册和结构识别的更快更准确的算法。此外，需要一个标准的大鼠和灵长类动物的器官和身体图谱来定量比较不同个体中蛋白质和RNA的表达。如果可以将组织透明化方法与多路复用稳健荧光原位杂交等新方法相结合，以便在脑切片上成像数十种mRNA，那就更好了。我们还希望将组织透明化方法与其他主要技术（包括单细胞RNA测序和质谱法）相结合，以获得整个器官和身体中RNA和蛋白质质量和数量的空间和时间信息。 在未来，组织去污技术将通过在治疗组和对照组中引入对整个器官和身体的无偏读数，显著影响药物开发过程。因此可以评估针对特定神经系统疾病的药物候选者是否能够穿过血脑屏障，以及它们是否能够在单个细胞水平上与大脑和脊髓中的预期靶点结合。到目前为止，利用特异性抗体靶向斑块中的淀粉样蛋白肽一直是努力寻找阿尔茨海默病有效治疗方法的主要尝试，但这种方法的临床试验尚未显示出任何效果。我们推测转化研究失败的主要原因之一是缺乏真正评估这些疗法的生物标记物的技术。 这些药物针对的是整个体内单个细胞的分辨率。因此，在体外动物模型中，监测药物在单个细胞水平上的生物分布和作用对于全面了解潜在的细胞机制并设计有效的药物至关重要。在这方面，纳米技术也将极大地促进生物医学科学中的许多领域，包括神经药理学的靶向药物递送。目前，基于纳米颗粒的药物的效果是通过粗略的成像方法（如生物发光）来评估的，这种方法只能检测到毫米级大小的信号，这大大限制了使用纳米颗粒执行纳米功能的能力。组织清洗方法将是载药纳米颗粒开发的关键技术，因为该方法可以在整个啮齿类和灵长类动物身上以单个细胞的分辨率识别这些载体。 由组织学方法提供的三维病理学将大大扩展在体外和临床环境中对人类组织的研究。例如，对癌症患者（比经典组织学大几千倍）进行活检标本的标记和成像，在单个细胞分辨率下对整个肿瘤进行诊断和分期，这将提供更快速、更准确的结果。最后，以厘米为单位成人组织的清除、标记和成像将成为揭示完整器官细胞结构的主要技术，并最终绘制出整个人脑中的回路图。 补充信息 本文的补充信息可在 https://doi.org/10.1038/s41583-019-0250-1 获得 。
