客户佳作|IDH3β与PAX6的正反馈机制:中国科学家揭开阿尔茨海默病的“代谢陷阱”(IF=40.8)

2025-06-23

简介:研究发现,阿尔茨海默病(AD)患者及转基因小鼠脑内三羧酸循环关键酶异柠檬酸脱氢酶 3β(IDH3β)水平显著下降,其敲低会导致氧化磷酸化解偶联、能量代谢降低及乳酸积累,乳酸作为乳酰来源促进组蛋白乳酰化,进而增强转录因子配对盒基因 6(PAX6)的表达。而 PAX6 作为 IDH3β 的抑制性转录因子,其升高又会反过来抑制 IDH3β 表达,形成IDH3β - 乳酸 - PAX6 -IDH3β 正反馈抑制环,最终导致 tau 过度磷酸化、突触损伤及学习记忆障碍。重要的是,研究表明通过上调 IDH3β 或下调 PAX6 可通过改善细胞能量代谢和减少组蛋白乳酰化,减轻 AD 样病理和认知缺陷。


在当今社会,阿尔茨海默病(AD)已经成为一个日益严峻的健康挑战。它就像一个无形的杀手,悄无声息地侵蚀着患者的大脑,让他们逐渐失去记忆、认知和生活自理能力。据统计,全球约有5000万AD患者,预计到2050年,这一数字将增长至1.52亿。如此庞大的患者群体,让我们不得不重视AD的研究和治疗。

今天,我们要介绍的这篇由华中科技大学的王建枝教授团队及合作者于2024年发表的优秀论文《A positive feedback inhibition of isocitrate dehydrogenase 3β on paired - box gene 6 promotes Alzheimer - like pathology》,为我们揭示了AD发病机制中的一个关键环节,或许能为AD的治疗带来新的希望。

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研究背景:葡萄糖代谢与AD的不解之缘

大脑是人体最耗能的器官之一,而葡萄糖则是大脑的主要能量来源。在AD患者的大脑中,葡萄糖代谢受损是一个早期且显著的特征。然而,其背后的根本机制一直是个未解之谜。

在三羧酸循环(TCA)中,异柠檬酸脱氢酶3(IDH3)是一种关键的限速酶。它就像一个勤劳的小工人,将异柠檬酸氧化脱羧为α - 酮戊二酸和CO₂,同时将NAD⁺转化为NADH,为呼吸链提供质子,促进能量供应和氧化磷酸化。IDH3由两个α催化亚基、一个β结构亚基(IDH3β)和一个γ交换亚基组成,其中IDH3β对于异四聚体的组装至关重要。

此外,组蛋白的翻译后修饰(PTM)也在细胞的生理和病理过程中发挥着重要作用。乳酸作为糖酵解的产物,能够诱导组蛋白乳酸化,从而影响基因的表达。

研究发现:IDH3β与PAX6的正反馈抑制环

IDH3β水平下降
通过对AD患者和AD转基因小鼠的大脑进行免疫染色发现,与健康对照组相比,AD大脑中的IDH3β信号显著降低。在5xFAD转基因小鼠模型中,Western印迹分析显示IDH3β随着年龄的增长而显著减少,在9个月和12个月时具有统计学意义,而IDH3α和IDH3γ的蛋白水平与对照组相比没有显著差异。这就像是一辆汽车的关键零部件出现了问题,导致整个代谢系统的运转受到影响。
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图1. AD 患者大脑及 AD 转基因小鼠海马体中 IDH3β 蛋白水平降低
a, b 免疫组织化学染色显示,与健康对照组相比,III 期 AD 患者海马体(HP)中的 IDH3β 表达显著减少。
c-f 蛋白质印迹分析表明,5xFAD 小鼠海马体中 IDH3β 蛋白水平随年龄增长而降低,而其同窝对照小鼠未出现该现象。IDH3α 和 IDH3γ 蛋白水平与对照组无显著差异。
g 免疫荧光染色显示,IDH3β 与神经元标志物(NeuN)、星形胶质细胞标志物(GFAP)和小胶质细胞标志物(IBA1)共定位。
h, i 免疫组织化学染色显示,12 月龄 5xFAD 小鼠海马体各亚区的 IDH3β 水平较对照组降低。
IDH3β敲低的影响

利用siRNA技术敲低N2a细胞中的IDH3β表达后,研究人员观察到IDH3β蛋白水平下降了75%,IDH3酶活性下降了62%。这导致了TCA循环中间产物α - 酮戊二酸(αKG)的减少,ATP生成减少,NAD与NADH的比率增加。进一步检查电子呼吸链中酶复合物的蛋白水平发现,ATP合酶的β - 亚基减少。这一系列的变化就像多米诺骨牌一样,一个倒下引发了一连串的反应,最终导致细胞的能量代谢出现严重问题。

Tau蛋白过磷酸化:IDH3β的下降导致tau蛋白在多个位点出现过磷酸化,这是AD的一个主要病理特征。

突触损伤:IDH3β敲低导致突触素 (Synaptophysin) 和突触后密度蛋白95 (PSD95) 等突触相关蛋白水平下降,表明突触功能受损。

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图2. 下调 IDH3β 可诱导突触可塑性与能量代谢受损的 AD 样病理改变
a-c 在 N2a 细胞中,应用 siRNA 可导致 IDH3β 蛋白水平降低 75%,其酶活性减少 62%。
d-f 敲低 IDH3β 可使 N2a 细胞中 α- 酮戊二酸和 ATP 水平下降,并导致 NAD+/NADH 比值升高。
g-h 敲低 IDH3β 可降低 N2a 细胞中 ATP 合酶 β 亚基(ATPB)的水平。
i-j 在 N2a 细胞中,敲低 IDH3β 可显著增加 tau 蛋白在 S199、T231、S262、S404位点的磷酸化水平,以及 T22 阳性 tau(寡聚 tau,箭头所示主条带)
k-m 在 2 月龄 C57BL/6 小鼠中,通过 Western blot 检测发现,敲低 IDH3β 可增加 tau 蛋白在 S199、T231、S262、S404位点的磷酸化水平及 T22 阳性 tau,并降低突触素(Syp)和突触后致密蛋白 95(PSD95)的表达水平。
n-q 在 2 月龄 C57BL/6 小鼠中,通过免疫荧光染色(n, o)和免疫组织化学染色(p, q)检测发现,敲低 IDH3β 可增加 AT8(pTau)的水平。(n, o)中 DG 区
,CA1 区,CA3 区;(p, q)中 DG 和 CA3 区
,CA1 区

学习和记忆缺陷:在动物模型中,IDH3β的减少显著损害了空间学习和记忆能力,表现为物体识别、水迷宫和恐惧条件反射测试中的认知障碍。
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图3. 下调 IDH3β 可诱发认知功能缺陷
a 对 2 月龄 C57BL/6 小鼠敲低 IDH3β 后,进行认知功能行为学测试:新物体识别测试(NOR)评估空间记忆,莫里斯水迷宫测试(MWM)评估空间学习记忆,情境恐惧条件反射测试(CFT)评估情境恐惧记忆。
b-d 在 NOR 测试中,2 月龄 C57BL/6 小鼠敲低 IDH3β 后,样本期探索时间与对照组相当,但对新物体的偏好性降低。
e-j 2 月龄 C57BL/6 小鼠敲低 IDH3β 后,空间学习记忆受损,表现为:MWM 训练 5 天期间寻找目标平台的潜伏期延长,第 7 天探针测试中穿越目标平台次数减少、在目标象限停留时间缩短,而两组游泳速度无差异。
k-m 通过 CFT 测试发现,敲低 IDH3β 损害 2 月龄小鼠的情境恐惧记忆,表现为冻结时间减少,而两组移动距离无差异。

乳酸与组蛋白乳酸化:IDH3β敲低导致氧化磷酸化解偶联,能量代谢降低,乳酸积累。增加的乳酸作为乳酰基的来源,促进了组蛋白乳酸化,从而增强了配对盒基因6(PAX6)的表达。这就像是一个开关被打开,原本沉默的基因开始活跃起来。

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图4. 下调 IDH3β 可增加组蛋白乳酰化并促进 PAX6 表达

a–c 在 N2a 细胞中,敲低 IDH3β 可导致乳酸水平升高及蛋白质整体乳酰化程度增加。

d–e 敲低 IDH3β 可使原代神经元中组蛋白 H4 的 Lys12和 Lys8位点、H3 的 Lys18 位点乳酰化水平升高。

f–g 敲低 IDH3β 可使 2 月龄 C57BL/6 小鼠海马体中组蛋白 H4 的 Lys12和 Lys8位点、H3 的 Lys18 位点乳酰化水平升高。

h–i 用 L - 乳酸(乳酸钠,20 mM 处理 24 小时)可使 N2a 细胞中组蛋白 H4 的 Lys12和 Lys8位点、H3 的 Lys18 位点乳酰化水平升高。

j 通过 GeneCards 和 JARPAR 公共数据库分析显示,IDH3β 基因启动子区的主要转录因子结合位点包括 PAX6、MZF1、ZBTB6、NHLH1、ZEB1 和 NR3C1。

k–m 敲低 IDH3β 可显著增加 N2a 细胞中 PAX6 的蛋白和 mRNA 水平,而 MZF1、ZBTB6(箭头所示主条带)、NHLH1、ZEB1 和 NR3C1 的蛋白表达水平与对照组无显著差异。

n–o 敲低 IDH3β 可显著增加 2 月龄 C57BL/6 小鼠海马体中 PAX6 的蛋白水平。

p–q 用 L - 乳酸(乳酸钠,20 mM 处理 24 小时)可增加 N2a 细胞中 PAX6 的表达。

r–s 免疫荧光染色显示,与对照组相比,AD 患者海马体中 IDH3β 水平显著降低,PAX6 水平显著升高。

PAX6的反馈抑制

PAX6作为IDH3β的抑制性转录因子,其水平升高反过来抑制了IDH3β的表达,形成了一个正反馈抑制环。这个环就像一个恶性循环,不断加剧细胞的代谢紊乱,导致tau蛋白过度磷酸化、突触损伤以及类似于AD的学习和记忆缺陷。

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图5. 上调 PAX6 继而抑制 IDH3β 表达
a, b 在 N2a 细胞中,通过染色质免疫沉淀(ChIP)实验证实 PAX6 可直接结合 IDH3β 启动子,包括非特异性对照(NC,转录起始位点上游 2800 bp 处的序列)、IDH3β-ChIP1 和 IDH3β-ChIP2。
c 在 N2a 细胞中,通过对 ChIP 产物进行 RT-PCR 验证了 PAX6 与 IDH3β 启动子的直接结合能力。
d 双荧光素酶报告基因实验显示,PAX6 与 IDH3β 的结合以 ChIP 1 和 ChIP 2 元件依赖的方式抑制 IDH3β 转录,且 ChIP 1 和 ChIP 2 的突变均消除了这种抑制作用。

e-h 在 N2a 细胞中,过表达 PAX6 抑制 IDH3β 表达,而敲低 PAX6 则促进 IDH3β 表达。
i, j 用 L - 乳酸(乳酸钠,20 mM 处理 24 小时)显著降低 IDH3β 蛋白水平,而在 N2a 细胞中敲低 PAX6 后,该降低作用被完全逆转。

治疗潜力

在AD转基因小鼠中,上调IDH3β和下调PAX6可以改善认知功能,逆转AD样病理。这表明打破IDH3β - 乳酸 - PAX6 - IDH3β的正反馈抑制环,通过上调IDH3β或下调PAX6,可以减轻AD神经变性和认知障碍。这就像是找到了一把钥匙,打开了治疗AD的新大门。

1. 上调IDH3β:

在AD转基因小鼠中上调IDH3β,能显著改善细胞能量代谢,恢复IDH3酶活性,增加α-酮戊二酸和ATP水平,同时降低乳酸和NAD+/NADH比率,并显著改善了小鼠的学习和记忆能力。

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图6. 上调 IDH3β 可改善 5xFAD 小鼠的学习记忆障碍及代谢异常

a, b 在上调 IDH3β 的稳定表达 tau 蛋白的 HEK293 细胞中,tau 蛋白在 S199、T231、S262、S404位点的磷酸化水平及 T22 阳性 tau显著降低。

c 将 eNeonGreen 非融合 AAV 病毒(AAV-CMV-IDH3β-2A-eNeonGreen)或空载体立体定向注入 5 月龄 5xFAD 小鼠或野生型对照小鼠的双侧海马,1 个月后通过荧光成像证实 IDH3β 在整个海马区的表达。

d 6 月龄 5xFAD 小鼠的 IDH3 活性降低,外源性表达 IDH3β 可恢复其活性。

e 5xFAD 小鼠的 α- 酮戊二酸(α-KG)水平降低,外源性表达 IDH3β 可使其恢复至正常水平。

f 5xFAD 小鼠的 ATP 水平降低,表达 IDH3β 可恢复 ATP 水平。

g 5xFAD 小鼠的 L - 乳酸水平升高,外源性表达 IDH3β 可使其恢复。

h 5xFAD 小鼠的 NAD+/NADH 比值升高,表达 IDH3β 可使其恢复。

i 实验流程示意图:病毒表达 1 个月后,通过行为学测试评估小鼠的学习记忆能力,包括新物体识别测试(NOR)、莫里斯水迷宫测试(MWM)和情境恐惧条件反射测试(CFT)。

j, k 通过 NOR 测试发现,上调 IDH3β 可增加 5xFAD 小鼠对新物体的偏好性。

l-p 上调 IDH3β 可改善 5xFAD 小鼠的空间学习记忆能力,表现为:MWM 训练 5 天期间寻找目标平台的潜伏期缩短,第 7 天探针测试中到达目标平台的潜伏期缩短、穿越目标平台次数增加、在目标象限停留时间延长。

q, r 通过 CFT 测试发现,上调 IDH3β 可改善 5xFAD 小鼠的情境恐惧记忆,表现为冻结时间恢复,而两组移动距离无差异。


上调IDH3β还逆转了AD样病理,包括减少Aβ斑块沉积、恢复神经元树突棘的数量、改善突触功能。

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图7.上调 IDH3β 减少 Aβ 斑块并改善树突 / 突触可塑性

a, b 免疫荧光染色显示,上调 IDH3β 可减少 5xFAD 小鼠海马各亚区的 6E10(Aβ)染色。

c, d 免疫组织化学染色显示,上调 IDH3β 可减少 5xFAD 小鼠海马各亚区的 6E10(Aβ)染色。

e, f Golgi 染色显示,上调 IDH3β 可增加 5xFAD 小鼠海马神经元的树突棘数量。

g, h Western blot 检测显示,上调 IDH3β 可恢复 5xFAD 小鼠海马中突触相关蛋白的表达水平。

i, j Sholl 分析显示,上调 IDH3β(慢病毒 lv-IDH3β-2A-GFP 转染 6 天,再用 Aβ 处理 24 小时)可挽救 Aβ 诱导的原代神经元复杂性丧失。

2. 下调PAX6:

鉴于PAX6对IDH3β的强抑制作用,研究人员还在AD转基因小鼠中下调了PAX6。

结果显示,下调PAX6同样改善了认知功能,减少了Aβ斑块,并恢复了突触相关蛋白的表达。

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图8. 下调 PAX6 改善 5xFAD 小鼠的记忆缺陷及 AD 样病理

a, b 实验流程示意图:将 AAV 病毒 AAV-U6-shRNA(PAX6)-CMV-mScarlet-WPRE 或对照 shRNA 病毒 AAV-U6-shRNA(NC2)-CMV-mScarlet-WPRE 立体定向注入 11 月龄 5xFAD 小鼠或野生型小鼠的双侧海马,1 个月后通过荧光成像证实病毒在整个海马区的表达。病毒表达 1 个月后,通过行为学测试评估小鼠的学习记忆能力,包括新物体识别测试(NOR)、莫里斯水迷宫测试(MWM)和情境恐惧条件反射测试(CFT)。

c, d 通过 NOR 测试发现,下调 PAX6 可增加 5xFAD 小鼠对新物体的偏好性。

e-i 下调 PAX6 可改善 5xFAD 小鼠的空间学习记忆能力,表现为:MWM 训练 5 天期间寻找目标平台的潜伏期缩短,第 7 天探针测试中到达目标平台的潜伏期缩短、穿越目标平台次数增加、在目标象限停留时间延长。

j, k 通过 CFT 测试发现,下调 PAX6 可改善 5xFAD 小鼠的情境恐惧记忆,表现为冻结时间恢复,而两组移动距离无差异。

l, m 免疫荧光染色显示,下调 PAX6 可减少 5xFAD 小鼠海马各亚区的 6E10(Aβ)染色。

n, o 免疫组织化学染色显示,下调 PAX6 可减少 5xFAD 小鼠海马各亚区的 6E10(Aβ)染色。

p, q Western blot 检测显示,下调 PAX6 可恢复 5xFAD 小鼠海马中突触相关蛋白的表达水平。

研究意义:为AD治疗带来新希望

这篇论文的研究成果为阿尔茨海默病的发病机制提供了新的见解。它揭示了IDH3β - 乳酸 - PAX6 - IDH3β正反馈机制在代谢紊乱中的作用,强调了IDH3β作为AD治疗新分子靶点的调节潜力。

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图9. 工作模型:IDH3β- 乳酸 - PAX6-IDH3β 正反馈环的形成及其驱动 AD 病理的机制
当 IDH3β(异柠檬酸脱氢酶 3β)水平下降时,三羧酸循环(TCA)速率降低,导致线粒体氧化磷酸化解偶联,细胞内乳酸(La)积累。乳酸作为乳酰供体,促进组蛋白乳酰化修饰,进而增强转录因子 PAX6 的表达。PAX6 通过结合 IDH3β 基因启动子的 ChIP1 和 ChIP2 元件,抑制 IDH3β 的转录,形成IDH3β↓→乳酸↑→组蛋白乳酰化↑→PAX6↑→IDH3β↓ 的正反馈恶性循环。这一环路最终加剧 tau 蛋白过度磷酸化、Aβ 沉积、突触功能损伤及学习记忆障碍。

通过上调 IDH3β 或下调 PAX6阻断该反馈环,可恢复细胞能量代谢(如 ATP 生成和 TCA 中间产物 α- 酮戊二酸水平),减少乳酸积累和组蛋白乳酰化,进而逆转 AD 样病理改变(如 Aβ 斑块减少、突触蛋白表达恢复),改善认知功能。

未来,我们或许可以通过开发针对IDH3β的药物,调节其表达或活性,打破这个正反馈环,从而改善AD患者的大脑代谢和认知功能。此外,这一发现也为AD的早期诊断提供了新的生物标志物,有助于我们更早地发现和干预疾病。

虽然目前距离真正的临床应用还有一段路要走,但这一研究无疑为AD的治疗带来了新的希望。相信在科研人员的不断努力下,我们一定能够攻克阿尔茨海默病这一难题,让更多的患者重获健康和幸福。

值得一提的是,文章中用到的经典AD模型5xFAD小鼠及其野生型对照由鼠来宝生物提供

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关于AD模型介绍,请参阅我们的往期文章:

经常熬夜可以预防老年痴呆?细谈阿尔茨海默症与小鼠模型

资料来源
Wang, X., Liu, Q., Yu, HT. et al. A positive feedback inhibition of isocitrate dehydrogenase 3β on paired-box gene 6 promotes Alzheimer-like pathology. Sig Transduct Target Ther 9, 105 (2024). https://doi.org/10.1038/s41392-024-01812-5

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41392-024-01812-5?sessionid=

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