Sci Immunol封面文章｜基因编辑小鼠告诉你Ddx55如何维护幼稚T细胞稳态

1. 基于机器学习的高通量筛选揭示了DDX55是幼稚T细胞稳态的先前未知的调节剂

为了识别幼稚T细胞稳态的关键调节剂，作者开发了一套整合了机器学习模拟基因敲除（in silico knockout）与遗传学分析的计算流程，名为IRENTH（identification of regulators for naïve T cell homeostasis,）。作者首先通过对ImmuNexUT中2040个RNA-Seq数据集及人类淋巴细胞数据集进行综合分析，基于香农熵（Shannon entropies）筛选出813个在CD4或CD8幼稚T细胞中特异性表达的基因。随后，利用OntoVAE模型对这些基因在幼稚T细胞中的功能作用进行系统评估，通过推断基因表达曲线对应的GO通路活性（PA），并模拟基因敲除（KOs）对潜在通路的影响。阳性对照基因（如BTG1、BTG2等）的敲除模拟结果验证了该模型在预测T细胞存活、激活及分化相关通路中的可靠性。为进一步评估模拟基因敲除（KOs）对幼稚T细胞特异性富集通路的影响，作者还采用稳健排名聚合（RRA）算法，聚焦于与T细胞稳态和增殖功能相关的途径，最终从813个基因中鉴定出178个功能相关基因，其中97个被进一步划分为41个酶类（ENZ）、31个转录因子（TFs）、17个RNA结合蛋白（RBP）和8种膜蛋白（MPS）。

为进一步识别具有遗传及表型关联的关键调控因子，作者整合了PAN-IK Biobank中淋巴细胞百分比（LYM%）的全基因组关联分析（GWAS）数据，从中筛选出10,482个与LYM%存在因果关联的单核苷酸多态性（SNP）。通过连锁不平衡（LD）分析（D’> 0.8为阈值），将上述筛选出的97个功能基因与这些SNP进行关联，发现其中50个基因与LYM%显著相关。其中，进化上高度保守的RNA解旋酶Ddx55与淋巴细胞表型的关联最为显著。公共数据库及GeneCards分析显示，Ddx55与哮喘、系统性红斑狼疮等免疫疾病相关，其模拟敲除可影响细胞凋亡及淋巴细胞稳态通路。在人与小鼠幼稚T细胞中，T细胞受体（TCR）刺激或向效应/记忆细胞分化均导致Ddx55表达下调，其表达模式也与IL7R、BTG1/2等已知T细胞稳态调控因子相似。综合表明，Ddx55可能在调控幼稚T细胞稳态中发挥关键作用。

2. Ddx55的缺失破坏了幼稚T细胞稳态

为探究Ddx55在维持幼稚T细胞稳态中的作用，作者通过将CD4-Cre转基因小鼠与Ddx55 Flox/Flox小鼠杂交，构建了T细胞条件性敲除小鼠模型（CD4-Cre; Ddx55 Flox/Flox，原文称为Ddx55-KO）。在该模型中，成熟T细胞中Ddx55表达缺失，但胸腺内T细胞发育未受影响。流式细胞术等实验结果显示，与野生型（WT）相比，Ddx55-KO小鼠外周淋巴器官中CD4和CD8 T细胞数量显著降低。稳态条件下，这些T细胞表现出凋亡率上升，然而CD4与CD8 T细胞群体内幼稚细胞与效应记忆T细胞（TEM）的比例并未改变。以上结果表明，Ddx55对维持幼稚T细胞在稳态环境下的存活具有关键作用。

为进一步明晰Ddx55在调控幼稚T细胞增殖平衡中的功能，作者使用Cell Trace Violet（CTV）标记纯化的CD45RBhi幼稚T细胞，然后将其移植至Rag2−/−宿主小鼠体内。结果显示，WT来源的幼稚T细胞能够发生广泛增殖，而Ddx55-KO来源的幼稚T细胞则增殖能力显著下降。在受体小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结（MLN）中，几乎检测不到Ddx55-KO幼稚T细胞的存在，且该群体未能浸润结肠组织，也未诱发慢性结肠炎。因此，Ddx55对维持幼稚T细胞稳态增殖至关重要。

3. Ddx55的缺失诱导了幼稚T细胞的基因组不稳定性

TCR与IL-7-STAT5以及 IL-2-STAT5信号通路的协同作用分别是调控T细胞稳态和TCR诱导的T细胞扩增的主要通路。为阐明Ddx55缺失引起幼稚T细胞稳态缺陷的信号机制，作者系统评估了Ddx55-KO对IL-2、IL-7及TCR信号通路的影响。结果显示，尽管Ddx55-KO幼稚T细胞存在显著增殖缺陷，其IL-7Rα（CD127）与IL-2Rα（CD25）表达水平均与野生型（WT）相当。在稳态条件下，经相应细胞因子刺激后，STAT5的磷酸化水平未发生改变；同时，TCR信号下游关键分子AKT1与ERK的磷酸化程度在WT与KO细胞间也无显著差异，提示这些经典信号通路并非Ddx55缺失导致幼稚T细胞稳态缺陷的主因。

为进一步解析其机制，作者对Ddx55-KO与WT幼稚T细胞进行了RNA-Seq分析，共鉴定出1017个上调与182个下调的差异表达基因。GO功能富集分析表明，这些基因显著富集于有丝分裂细胞周期检查点及DNA损伤应答相关通路。GSEA分析进一步显示p53信号通路及DNA损伤相关凋亡基因集明显激活，与该研究中观察到的细胞周期阻滞及凋亡增加相一致。此外，Ddx55-KO细胞中磷酸化γH2AX（DNA断裂和基因组不稳定性的标记物之一）水平显著上升，进一步证实DNA断裂与基因组不稳定性增强。这些证据共同说明，Ddx55缺失会广泛激活DNA损伤应答相关的转录程序，进而诱发基因组不稳定、细胞周期停滞及凋亡。

为验证p53激活在Ddx55-KO表型中的作用，研究者构建了p53与Ddx55双条件敲除小鼠。结果显示，尽管双敲细胞在体内外仍存在增殖受损，p53的缺失显著改善了Ddx55-KO幼稚T细胞的存活率，并在稳态条件下恢复了T细胞群体数量。

综上，Ddx55通过维护基因组完整性，在幼稚T细胞稳态维持中发挥关键作用，其缺失所引发的幼稚T细胞缺陷主要依赖于p53介导的DNA损伤应答通路。

4. Ddx55敲除导致幼稚T细胞中TEs的激活

为进一步探究Ddx55在维持基因组稳定性中的作用机制，作者首先通过GO与GSEA富集分析发现，差异表达基因在先天抗病毒免疫反应通路中显著富集。在Ddx55敲除的幼稚T细胞中，I型及II型干扰素以及干扰素刺激基因（ISGs）表达水平显著上升，表明其抗病毒免疫反应被激活。研究表明，除外源病毒感染外，细胞内源性转座元件（TEs）的异常表达可产生病毒样胞质RNA或DNA，同样能够激活先天性免疫反应；而TEs的表达失控还会进一步引起基因组不稳定。基于此，作者提出假设：Ddx55缺失可能导致TEs的重新激活。随后的实验结果表明，在Ddx55-KO幼稚T细胞中，包括短散在元件（SINE）、长散在重复序列（LINE）和长末端重复序列（LTR）在内的400多种TEs中，超过80%的表达水平上调。综上所述，Ddx55通过抑制TEs活性，在维持幼稚T细胞基因组稳定性中发挥关键作用。

5. TEs引起的R环积累导致Ddx55-KO小鼠中幼稚T细胞DNA损伤

为探究Ddx55缺失导致幼稚T细胞死亡的关键机制，作者发现在稳态条件下，WT与Ddx55-KO小鼠中磷酸化的TANK结合激酶1（TBK1）及干扰素调节因子3（IRF3）水平无显著差异，且TBK1抑制剂处理未能改善Ddx55-KO幼稚T细胞的死亡。表明了在这种情况下，先天性抗病毒免疫反应并不是引起细胞死亡的关键因素。作者还评估了逆转录子诱发的基因组不稳定性是否参与其中。使用逆转录酶抑制剂阻断RNA逆转录后，Ddx55-KO幼稚T细胞的凋亡与增殖缺陷仍未被挽救，表明逆转录子同样并非主要原因。

R环是转录过程中形成的三链核酸结构，TEs是R环的丰富来源，并与基因组的不稳定性相关。免疫荧光显示，Ddx55-KO T细胞中S9.6抗体识别的R环显著增多，且部分与DNA损伤标志γH2AX共定位，该信号可被RNase H1降解，证实Ddx55缺失引起R环积累。为了进一步评估失调的R环在T细胞增殖中的作用。作者将来自UBC-CreERT2; Ddx55 Flox/Flox（原文称为Ddx55ERT2）小鼠的幼稚T细胞（CTV标记）用过表达RNase H1逆转录病毒感染，在体外激活前用他莫昔芬和溶剂处理后进行γH2AX检测。结果表明他莫昔芬诱导的Ddx55缺陷型T细胞用RNase H1过表达病毒处理，可显著减轻DNA损伤并部分恢复增殖能力。

综上，Ddx55缺失通过引起R环积累，进而导致DNA损伤与增殖缺陷。

6. Ddx55直接与MYC相互作用以防止其与TEs结合

为阐明Ddx55调控转座子（TEs）表达的分子机制，作者通过ATAC-Seq发现，在Ddx55敲除的幼稚T细胞中，TEs染色质可及性上升不明显，且伴随与TEs沉默相关的H3K9me3组蛋白修饰水平升高，提示存在补偿性表观遗传沉默机制。进一步分析显示，Ddx55缺失并未影响TEs转录本的降解速率，但RNA聚合酶II（Pol II）在TEs基因座上的结合显著增加，尤其是在表达上调的TEs区域。Pol II暂停指数（PI，转座子启动子/基因启动子附近的Pol II信号密度与转座子/基因体内的信号密度之比）未发生改变，表明Ddx55并不影响Pol II的暂停或释放，而是通过限制Pol II向TEs位点的募集发挥抑制作用。

机制上，基序富集分析显示Ddx55靶向的TEs富含MYC-MAX复合体结合序列；CUT&Tag-qPCR实验进一步证实Ddx55缺失后MYC在这些TEs位点上的结合增强，而Myc表达水平不变。免疫共沉淀实验表明Ddx55与MYC在体内存在直接相互作用。EMSA实验结果进一步揭示，Ddx55能以剂量依赖方式直接抑制MYC与含MYC结合基序的TEs序列结合。

综上，Ddx55通过与MYC直接相互作用，阻止其结合至TEs基因座，进而限制Pol II的招募，最终抑制TEs的转录激活。

7. Ddx55靶向幼稚T细胞中具有增强子和启动子样功能的TEs

MYC作为T细胞激活与扩增的关键调控因子，作者发现其靶标中包括一类由Ddx55调控的转座子（TEs）。在野生型小鼠幼稚T细胞中，这些TEs表现出活跃的染色质状态，其特征为H3K9me3水平降低、Pol II占有率及染色质可及性增加，提示它们参与T细胞启动过程。转录组时序分析显示，在抗CD3/CD28刺激下，TEs呈现六种不同的表达模式簇，其中簇4和6显示T细胞激活时上调，簇2和5显示下调，簇1和簇3具有可变的表达模式。大部分Ddx55靶向的TEs在激活期间上调，其中超过半数在8小时内迅速上调并维持高表达至24小时（簇4）。且其表达与邻近基因呈正相关。这些TEs定位在1059个参与T细胞激活与增殖的蛋白编码基因附近；约25%的邻近基因在T细胞激活早期上调，在Ddx55-KO的幼稚T细胞中，约20%的基因即使无TCR刺激也过度表达，并富集于细胞周期相关通路，表明 Ddx55靶向的TEs在快速诱导促进T细胞激活的基因中发挥作用。

进一步表观遗传分析揭示，80%以上的Ddx55靶向TEs位于转录起始位点（TSS）远端（>2 kb），呈现增强子特征（H3K27ac高、H3K4me1高、H3K4me3低），而近端TEs（≤2 kb）则具启动子特征（H3K27ac高、H3K4me1高、H3K4me3高），其他TEs无此特性。通过CSI-ANN模型鉴定出19个增强子样和29个启动子样TEs，它们靶向199个富集于T细胞激活通路的基因，如Cd4基因座上游231 bp的启动子样转座子（Cd4-prmt-TE），Mapk3和 Rps6ka1基因座上游345 kb和153 kb的增强子样转座子（Mapk3-enh-TE和Rps6ka1-enh-TE）。在Ddx55-KO T细胞中，这些TEs被激活且靶基因表达上升；荧光素酶报告实验证实它们以MYC基序依赖性方式发挥调控功能，其中Rps6ka1-enh-TE活性最强，其敲除导致Rps6ka1表达显著下降。综上，Ddx55靶向的TEs具有增强子或启动子样活性，在T细胞激活中起关键调控作用。