从 “听天由命” 到 “指哪打哪”：一文了解小鼠基因编辑技术

1) 基因编辑技术 (Gene editing technology)：通过特定工具对生物体基因组进行定点修饰（如敲除、敲入、碱基替换等）的技术，可实现对目标基因功能的精准调控，常用工具包括ZFNs、TALENs、CRISPR-Cas9等。

2) 转基因（Transgenesis）：将外源基因通过一定方式导入生物体基因组中，使其在生物体内表达的技术，早期常通过随机插入方式实现，无法控制基因插入位置。

3) 基因敲除（Knockout, KO）：通过基因编辑技术使目标基因失去功能（如碱基插入/缺失导致阅读框移位），从而研究该基因生理功能的方法。

4) 基因敲入（Knock-in, KI）：在基因组特定位置插入外源基因片段（如报告基因、突变基因），实现精准的基因修饰，通常依赖同源定向修复（HDR）机制。

5) 条件性敲除（Conditional Knockout, cKO）：利用Cre/loxP系统等工具，在特定组织、特定发育阶段或药物诱导下实现目标基因敲除，避免全身性敲除可能导致的胚胎致死或代偿效应。

6) 同源重组（Homologous Recombination, HR）：细胞内一种精准的DNA修复机制，需依赖与断裂位点两侧同源的DNA片段作为模板，可实现基因的精准修饰，早期ES细胞打靶技术核心原理即为此。

7) 非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）：细胞内一种不依赖同源模板的DNA双链断裂（DSB）修复机制，修复过程中易产生碱基插入或缺失，常被用于实现基因敲除。

8) 同源定向修复（Homology-Directed Repair, HDR）：细胞内依赖同源模板的DNA双链断裂修复机制，可实现基因的精准敲入或碱基修正，需额外提供同源修复模板。

9) sgRNA（single guide RNA）：CRISPR-Cas9系统中的引导RNA，由crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating crRNA）融合而成，可特异性识别基因组中的靶序列，引导Cas9蛋白进行切割。

10) PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）：CRISPR-Cas9系统中Cas9蛋白识别并结合的关键序列，通常位于靶序列3'端，常见序列为5'-NGG-3'（N代表任意碱基），是Cas9实现特异性切割的必要条件。

11) 碱基编辑（Base editors）：CRISPR衍生技术，将nCas9（失活部分内切酶活性的Cas9）与碱基脱氨酶融合，可在不产生双链断裂的情况下实现单碱基的精准替换（如A-to-G、C-to-T）。

12) 先导编辑（Prime editors）：CRISPR衍生技术，由nCas9、逆转录酶和pegRNA（prime editing guide RNA）组成，可在不产生双链断裂的情况下实现单碱基替换、短片段插入或缺失。

小鼠与人类的基因约有85%高度相似，并具有繁殖快、世代短、饲养成本低的特点，是研究基因功能和人类疾病最经典的哺乳动物模型，在生物医学领域有着无可替代的地位 (Hall et al., 2018)。

过去，要弄清楚某个基因到底“管”什么，只能大海捞针地观察自然突变；随着基因编辑技术的蓬勃发展，科学家已经能够在小鼠受精卵里“指哪打哪”，让目标基因失去功能、修正突变，甚至插入全新片段——这就是基因编辑技术带来的革命。

小鼠基因编辑并非一蹴而就，而是经历了从“大海捞针”到“精确制导”的数十年演变。

1. 经典时代：转基因与基因敲除的萌芽（1970-1990年代）

早期的基因操作主要依赖随机插入（Transgenesis）和胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）同源重组（Homologous Recombination, HR）。

随机插入

1974年，Jaenisch和Mintz将SV40病毒DNA插入到小鼠早期胚胎中，首次创建了基因修饰小鼠，但无法将外源基因传递给后代 (Jaenisch & Mintz, 1974)。1980年，Gordon等 (Gordon et al., 1980) 通过原核注射的方式将单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）和SV40病毒DNA片段注射到受精小鼠卵母细胞的原核中，得到了包含目的DNA的小鼠，为重组DNA技术研究哺乳动物系统中的基因调控和细胞分化问题提供了思路。1982年，Palmite等 (Palmiter et al., 1982) 将大鼠生长激素基因（Rat Growth Hormone gene, rGH）与小鼠金属硫蛋白启动子（MT-1 promoter）融合，然后通过原核显微注射导入小鼠受精卵中，成功获得的小鼠会过量表达生长激素的“超级小鼠”。

早期的随机转基因的方法虽然能创造转基因小鼠，但无法控制基因插入的位置，效率低且结果不稳定。

胚胎干细胞打靶

真正的突破出现在利用胚胎干细胞（ES cells）进行同源重组的时代。1981年，Evans等(Evans & Kaufman, 1981)从小鼠胚胎中分离并培养出胚胎干细胞，为基因打靶（gene targeting）奠定了基础；1987年，Thomas和Capecchi等(Thomas & Capecchi, 1987)首次在小鼠胚胎干细胞中实现基因打靶，即通过同源重组对特定内源基因Hprt进行了突变。

2007年，ES细胞打靶技术的奠基人——马丁·埃文斯爵士（Sir Martin Evans）、马里奥·卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗·史密斯（Oliver Smithies）共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。

利用ES细胞打靶生成基因修饰小鼠流程如下所示（图1）(Bouabe & Okkenhaug, 2013)：

图1. 使用同源重组ESC克隆生成具有目标基因组修饰的小鼠

ES细胞打靶这项技术耗时长、步骤繁琐，但它带来的基因敲除小鼠彻底改变了功能基因组学研究。

2. 精确定位：锌指核酸酶与转录激活因子样效应物核酸酶（2009-2012年）

同源重组虽然精确，但效率低下。为了提高效率，科学家开始探索能定向切割DNA的工具。

锌指核酸酶 (Zinc-finger nucleases, ZFNs)（图2）和转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases, TALENs)（图3）是第一批实现“精确制导”的工具。它们通过设计特定的蛋白质结构，使其能够识别并结合到基因组中的特定序列，然后利用Fok I核酸内切酶进行切割(Wijshake et al., 2014)。

图2. ZFNs概述。A. ZFN由3~6个与Fok I限制酶催化域融合的锌指蛋白组成。每个锌指蛋白都能与2个核苷酸结合，并能引导ZFN到达基因组中的特定目标位点。要使两个非特异性Fok I核酸酶二聚化，就必须有两个ZFN靶向基因组DNA两侧的特定序列。B. 两种FokI核酸酶的二聚化会在目标位点诱导DSB。随后通过不精确的NHEJ途径进行DNA修复，可引入所需的基因组修改，如基因破坏。另外，DNA修复模板的添加也可促进HDR介导的基因组编辑，从而实现基因校正或添加。

图3. TALENS概述。A. 由一个N端域、一个中央DNA结合重复域和一个包含两个核定位信号（NLS）的C端域以及激活域（AD）构成的TALE表征。每个RVD可识别特定的DNA碱基配对和序列重复，识别特定的DNA序列，并通过活化作用激活特定效应宿主基因的表达。TALEN包含12~20个特异性重复序列（如图中所示，例如红色、绿色、蓝色、黄色分别识别胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤），使其能够识别并结合特异性的DNA碱基序列。B. 与靶位点结合的两个TALEN蛋白结合可促进FokI的二聚化，并产生由TALEN诱导的DSB，随后引发NHEJ或者HDR修复途径。

2013年，Davies等利用TALENs成功在C3H和C57BL/6J背景下构建了Zic2基因突变小鼠 (Davies et al., 2013)，这些小鼠将突变等位基因以100%的效率传递给后代。

ZFNs和TALENs这两种基因编辑技术虽然极大地提高了基因编辑的效率和靶向性，但它们的构建和设计仍然复杂且昂贵。

3. 革命性突破：CRISPR-Cas9系统（2012年至今）

CRISPR-Cas9系统的发现和应用，是小鼠基因编辑史上的里程碑。CRISPR-Cas9源于细菌的免疫系统，是细菌抵抗外来病毒入侵的方式，其免疫机制可以分为3个阶段 (Le Rhun, Escalera-Maurer, Bratovič, & Charpentier, 2019)（图4）：

1）适应阶段

细菌通过Cas1-Cas2复合物从入侵的DNA/RNA中识别和提取原间隔子，并将其整合到自身CRISPR序列中，形成新的间隔序列。

2）表达/成熟阶段

CRISPR序列转录并加工成与外来基因序列匹配的指导RNA（guideRNA，gRNA），每个gRNA分子包含间隔区和重复序列，与Cas9蛋白结合。

3）干扰阶段

Cas9蛋白和gRNA形成的复合物定位到与其同源的入侵核酸靶点上，并激活Cas9蛋白内切酶活性，切割目标DNA序列，从而发挥免疫功能。

图4. CRISPR-Cas9（S. pyogenes）的免疫机制（来源：BioRender）

2012年，Jinek等 (Jinek et al., 2012) 证明将双tracrRNA:crRNA优化设计为单RNA嵌合体时，也能指导Cas9切割靶标区域DNA双链。

CRISPR-Cas9系统的工作原理核心在于gRNA（guide RNA）对Cas9核酸酶的引导。gRNA能够将Cas9精确引导至基因组中的特定靶点，Cas9随后在靶点处产生双链断裂（DSB）。细胞利用自身的两种修复机制对DSB进行处理（图5）：

1）非同源末端连接（NHEJ）：这种不精确的修复方式通常导致碱基的插入或缺失，从而实现基因的敲除（Knockout）。

2）同源定向修复（HDR）：在提供同源修复模板的情况下，细胞可以利用该模板对DSB进行精确修复，从而实现精确的基因敲入（Knock-in）。

图5. CRISPR-Cas9 基因编辑原理与应用 (Jiang & Doudna, 2017)

2013年，张锋等(Wang et al., 2013)首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术改进并应用于小鼠，同时将Cas9 mRNA与Tet1和Tet2 sgRNA共同注射到受精卵中，产生了携带两个基因突变的小鼠；而将Cas9 mRNA、sgRNA与突变寡核苷酸donor共注射可同时在两个靶基因中产生精确的点突变（图6）。

图6. 一步生成携带多个突变的小鼠。上图：通过NHEJ引入的多个靶向突变和随机插入/缺失。下图：通过HDR介导的修复引入的多个预定突变。

CRISPR/Cas9相对于ZFNs和TALENs，技术操作简单、成本低廉、效率极高，使得小鼠基因编辑从少数专业实验室的操作，普及到了全球的生物医学实验室。两位关键科学家埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）因此获得了2020年的诺贝尔化学奖。

CRISPR如何编辑DNA？（Andrea M. Henle)

诺奖得主Jennifer Doudna亲授CRISPR-Cas9基因编辑原理 (iBiology.org)

此外，基于CRISPR的衍生技术，如碱基编辑（Base editors）(Komor et al., 2016)可实现不依赖双链断裂的单碱基精确替换，而先导编辑（Prime editors）(Anzalone et al., 2019) 则能在无双链断裂的情况下，完成单碱基替换、短片段插入或缺失，进一步提高了基因编辑的精度和安全性（图7）。

图7. 碱基编辑（Base editors）和先导编辑（Prime editors）示意图(Pacesa, Pelea, & Jinek, 2024)

CRISPR基因编辑及新用途 (Nature)

2. 显微注射：雌性供体小鼠在受精前2天注射PMSG（5 IU），47小时后注射hCG（5 IU），并立即与雄鼠交配，次日早晨采集胚胎，将sgRNA与Cas9 mRNA（或Protein）一起显微注射到小鼠受精卵(Qin et al., 2016)。

2. 胚胎移植：将存活胚胎移入假孕母鼠子宫，19天后F0代出生（图8）。

3. 基因型鉴定：Founder小鼠可在10至14日龄时进行基因分型，PCR+Sanger测序检测突变，阳性鉴定小鼠后续进行扩繁建立品系。

图8. CRISPR-Cas9介导的小鼠模型生成流程图 (Qin et al., 2016)

1. 构建人类疾病模型

这是基因编辑小鼠最主要的应用。通过在小鼠基因组中精确地引入与人类疾病如阿尔茨海默病(Zhong et al., 2024)、癌症 (Cheon & Orsulic, 2011; Khaled & Liu, 2014)、亨廷顿舞蹈病 (Farshim & Bates, 2018)、囊性纤维化 (McCarron et al., 2021) 相同的基因突变，创造出高度模拟人类病理特征的疾病模型小鼠，能够深入探索疾病的发病机制、发展过程及潜在治疗方法 (Lim et al., 2020)。

2. 探索和验证基因功能

通过敲除、敲入或者条件性敲除特定基因，或结合基因敲低 (Knockdown)和激活技术，科学家可以观察小鼠的生理功能、行为或发育过程受到何种影响，从而确定该基因的生理功能。例如，科学家可以创建条件性敲除小鼠，实现在特定组织、特定时间点关闭某个基因，以研究其在生命不同阶段和器官中的精确作用。

从早期的随机转基因、ES细胞打靶，到三代“基因魔剪”— ZFNs、TALENs、CRISPR，再到碱基/先导编辑，小鼠基因编辑技术用了数十年时间完成了“从粗糙到精准、从单基因到多基因、从实验室到临床”的三级跳。今天，我们在小鼠身上“剪”出的每一次突变，都是未来人类战胜遗传病、癌症、代谢综合征的一块拼图。可以预见，这一掀开生命科学革命的基因编辑技术，有着无穷的潜力。

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Anzalone, A. V., et al. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 576(7785), 149-157. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4

Bouabe, H., & Okkenhaug, K. (2013). Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol, 1064, 315-336. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-601-6_23

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