从原理到实战：慢病毒载体系统解析
在基因功能研究中，如何高效、稳定地将目的基因导入靶细胞是实验成功的关键。相比于腺病毒（Adenovirus, AdV）和腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV），慢病毒（Lentivirus, LV）载体具有宿主范围广、免疫原性低、可容纳较大片段（约8 kb）以及能整合至宿主基因组实现长期表达等优势。
早期的慢病毒载体存在安全性隐患，但随着第二代、第三代自身失活（Self-inactivating, SIN）载体系统的开发，其生物安全性已得到显著提升，符合BSL-2实验室操作标准。
慢病毒结构与侵染机制
慢病毒属于逆转录病毒科，其基因组为两条相同的正链RNA。其侵染细胞并表达基因的过程是一个精密的生物学级联反应。
1）慢病毒结构特点
以HIV⁃1为例，HIV-1是一种球形包膜颗粒，直径据报道范围约为120～200nm (Briggs et al., 2003)，HIV-1基因组约为9.7 kb，包含多个顺式作用元件和9个开放阅读框，使其能够产生三种主要多蛋白前体Gag（Group⁃specific antigen）、Pol（Polymerase）和Env（Envelope）；两种调控蛋白Tat（Trans ⁃ activator of transcription）和Rev（Regulator of virion）以及四个辅助蛋白Vif（Viral infectivity factor）、Vpr（Viral protein R）、Vpu（Viral protein U）和Nef（Negative factor）(Dwivedi et al., 2024; Engelman & Cherepanov, 2012)（图1）。
Gag编码四个结构蛋白：基质蛋白（Matrix，MA）、衣壳蛋白（Capsid，CA）、核衣壳蛋白（Nucleocapsid，NC）以及p6蛋白；Pol编码病毒复制所必需的蛋白酶（Protease，PR）、逆转录酶（Reverse transcriptase，RT）以及整合酶（Integrase，IN）；Env编码含有糖蛋白120（gp120）和糖蛋白41（gp41）的Env多蛋白 (Dwivedi et al., 2024)。Tat和Rev分别参与病毒RNA转录的激活以及对病毒RNA转录本剪接与核输出过程的调控 (Balachandran et al., 2017)。
图1. HIV病毒颗粒及基因组示意图 (房恩岳, 2023)
2）侵染机制
HIV感染宿主细胞的过程包括多个连续步骤：病毒首先与宿主细胞表面的CD4受体及相应共受体结合，随后与细胞膜融合；病毒衣壳发生脱壳，HIV RNA及相关蛋白质释放至细胞质中；病毒RNA被逆转录为DNA，并形成整合前复合物（pre-integration complex，PIC），随后转运进入细胞核。在细胞核内，病毒DNA整合入宿主基因组，继而经转录和翻译产生新的病毒RNA和病毒蛋白。这些组分被转运至细胞膜处组装成未成熟的病毒颗粒。最终，新生病毒通过出芽方式释放，病毒蛋白酶切割结构多聚蛋白生成成熟的Gag蛋白，从而形成具有感染性的成熟病毒粒子 (Barre-Sinoussi et al., 2013)。
图2. HIV-1复制周期示意图 (Barre-Sinoussi, 2013)
慢病毒载体的发展历程
慢病毒载体的开发源于对慢病毒基因组的工程化改造，其基本策略是将慢病毒基因组的关键组成元件重构并组合至重组质粒DNA（plasmid DNA，pDNA）中。随后，通过将这些pDNA转染入生产细胞系以获得病毒颗粒。经系统改造后的慢病毒基因组在保留病毒关键生物学功能的同时，可显著提高可包装的遗传有效载荷容量，抑制病毒复制能力，并降低其致病性 (Kay et al., 2001; Rothe et al., 2013; Vannucci et al., 2013)。
原生HIV-1的侵染起始于包膜蛋白gp120识别靶细胞表面的CD4受体以及辅助受体（CCR5或CXCR4），这限制了其感染谱主要集中在T淋巴细胞和巨噬细胞。为了拓展其应用范围，现代重组慢病毒通常采用“伪分型”（Pseudotyping）策略，使用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）替换原有的Env蛋白。VSV-G能识别广泛分布于脊椎动物细胞表面的低密度脂蛋白受体（LDLR），这赋予了慢病毒极广的宿主范围 (Zhuchkov et al., 2025)。
第一代慢病毒载体系统
通过将病毒基因分散至三个相互独立的质粒中构建，以降低产生具有复制能力的慢病毒（replication-competent lentivirus，RCL）的风险。该系统包括：
（1）包装（Packaging）质粒：含有绝大多数HIV基因（gag, pol, tat, rev以及辅助基因vif, vpr, vpu, nef），仅去除了包膜基因env。
（2）包膜（Envelope）质粒：引入VSV-G（水泡性口炎病毒糖蛋白），替代HIV原本的包膜蛋白，赋予其极广的亲嗜性。
（3）穿梭（Transfer）质粒：携带目的基因和完整的LTR序列。
图3. 第一代慢病毒载体系统 (Labbe et al., 2021)
第二代慢病毒载体系统
去除了包装质粒中的辅助蛋白Nef、Vpr、Vif和Vpu，因为这些蛋白与疾病的进展、致病性以及在人类群体中的传播有关，但并非病毒功能（如逆转录、整合或成熟）所必需的（图4） (Haas et al., 2000)。
图4. 第二代慢病毒载体系统 (Labbe et al., 2021)
第三代慢病毒载体系统
对转移质粒的5' HIV LTR序列进行了修改，并将其替换为CMV或RSV启动子，从而能够从系统中去除tat并进一步防止RCL的形成。最后，包装质粒中的Rev元件被移除，并构建到一个新的调控（Regulatory）质粒上，从而形成了一个四质粒系统，以进一步增强对RCL形成的防护能力（图5） (Vink et al., 2017)。
图5. 第三代慢病毒载体系统 (Labbe et al., 2021)
图6. 慢病毒载体相关基因及功能 (Labbe, 2021)
表1. 三代慢病毒载体系统对比
慢病毒包装系统与流程
目前实验室最常用的是第三代包装系统。该系统将病毒组分拆分到4个质粒中，并去除了Tat基因，仅由Rev基因辅助核输出，极大地降低了产生具有复制能力慢病毒（RCL）的风险。
本示例方案利用聚乙烯亚胺 (PEI) 转染法，将慢病毒载体转染至293T细胞，从而制备慢病毒。该方法可根据不同的包装细胞系或转染试剂进行调整。制备的慢病毒可用于多种下游应用，例如构建稳定细胞系。
图7. 慢病毒载体生产流程概览
(www.addgene.org/guides/lentivirus)
病毒包装具体操作流程（Addgene示例）：
www.addgene.org/protocols/lentivirus-production/
1. 在10 cm培养皿中，用DMEM完全培养基接种3.8×10⁶个293T包装细胞。
2. 将细胞在37°C、5% CO₂条件下培养约20 h。
3. 将三种转染质粒混合后加入OptiPro SFM培养基中：
表2. 试剂及用量
* 应针对每种转移质粒优化质粒浓度和比例。
4. 将500 μL PEI-OptiPro SFM与适量的PEI混合，使DNA与PEI的质量为1:3（每10 cm培养皿共1000 μL）。
5. 将稀释后的PEI混合物轻轻加入到稀释后的DNA混合物中。在轻轻晃动稀释后的DNA试管的同时，逐滴加入稀释后的PEI混合物。将混合物在室温下孵育12-15分钟。
6. 在孵育期间，向15 mL锥形瓶中加入10 mL DMEM完全培养基，并向锥形瓶中加入适量的25 mM氯喹，使培养皿中的最终浓度（加入转染混合物后）为25 uM氯喹。
7. 孵育后，将DNA:PEI-Max混合物加入含有培养基和氯喹的锥形瓶中，并充分混合。
8. 轻轻地从先前已接种菌种的10 cm培养皿中吸出培养基。
9. 小心地将转染混合物缓慢滴加到10 cm培养皿中，注意不要扰动细胞。
10. 将细胞培养18小时，或直至第二天早上。
11. 第二天早上，小心吸出培养基。用10 mL DMEM Complete或OptiPro SFM 替换培养基。
12. 培养细胞。
13. 病毒可在转染后48、72和96 h分别进行收集，可单独收集，也可将所有单独收集的病毒液混合收集。如果采用混合收集，请将收集的培养基转移至聚丙烯储存管中，并在两次收集之间于4°C下保存。
14. 将病毒上清液以2100 rcf离心5 min，以沉淀收获过程中收集到的任何包装细胞。
15. 将上清液通过0.45 μm PES滤膜过滤。
16. 病毒上清液可在4°C下保存数小时，但应尽快分装并在液氮中速冻，然后储存在-80°C下，以避免滴度损失。
应用场景
1）稳转细胞系构建
利用慢病毒将shRNA、CRISPR/Cas9 sgRNA或cDNA整合入细胞基因组，配合抗生素（如Puromycin）筛选，可建立长期稳定敲除或过表达的细胞株。这是研究基因功能丧失（Loss-of-function）或获得（Gain-of-function）的基础手段。
2）难以转染细胞的操作
对于原代细胞（如T细胞、BMSCs）和悬浮细胞，脂质体转染效率极低，慢病毒感染是首选方案。
3）CAR-T细胞治疗
在临床领域，慢病毒载体被广泛用于构建嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）。例如，FDA批准的Kymriah即利用慢病毒载体将抗CD19的CAR基因导入患者T细胞中，用于治疗急性淋巴细胞白血病 (Milone & O'Doherty, 2018)。
4）活体成像与基因治疗
通过包装携带Luciferase的慢病毒，可构建用于活体成像的肿瘤模型；在基因治疗中，慢病毒被用于矫正遗传性疾病（如地中海贫血）。
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参考文献
Addgene. Lentivirus Production. https://www.addgene.org/protocols/lentivirus-production/
Balachandran A, et al. Identification of small molecule modulators of HIV-1 Tat and Rev protein accumulation. Retrovirology, 2017, 14(1): 7.
Barre-Sinoussi F, et al. Past, present and future: 30 years of HIV research. Nature Reviews Microbiology, 2013, 11(12): 877-883.
Briggs J A, et al. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. The EMBO Journal, 2003, 22(7): 1707-1715.
Dwivedi R, et al. HIV-1 capsid and viral DNA integration. mBio, 2024, 15(1): e0021222.
Engelman A, Cherepanov P. The structural biology of HIV-1: mechanistic and therapeutic insights. Nature Reviews Microbiology, 2012, 10(4): 279-290.
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Zhuchkov V A, et al. Switchable Retargeting of Lentiviral Vectors Through a VSV-G-Binding Adapter Molecule. Viruses, 2025, 17(12).
房恩岳，张丽萍，马雪征等。慢病毒载体系统及其安全性研究进展 . 病毒学报，2023, 39 (4): 1181-1192.