客户佳作 | 揭示抗瘢痕新机制：MCT1-H3K23la-HEY2/COL11A1通路

增生性瘢痕（Hypertrophic Scar, HS）是以成纤维细胞异常活化与细胞外基质过度沉积为特征的纤维化疾病，通常是烧伤、创伤、手术后等最常见的并发症之一，不仅影响外观，还伴随瘙痒、疼痛、关节活动受限等伴生病症，严重影响患者生活质量。但长期以来，其代谢-表观遗传调控机制尚未阐明。

亮点

1.发现并证实MCT1-H3K23la-HEY2/COL11A1特异性调控轴，解析出由COL11A1稳定MCT1构成的病理性自强化环路，明确H3K23la为瘢痕纤维化关键表观遗传修饰。

2.从基因敲除与药物干预双重角度证实MCT1是增生性瘢痕关键治疗靶点，为临床提供代谢-表观靶向抗瘢痕的全新策略与转化依据。

研究方法与结果

1.增生性瘢痕中糖酵解与乳酸转运能力增强

（1）主要方法：采用比色法测定乳酸水平，结合非靶向与靶向能量代谢组学、RT-qPCR、Western blot、免疫组织化学（IHC）及免疫荧光共染色（IF），系统比较正常皮肤（NS）与增生性瘢痕（HS）组织的代谢特征。

（2）核心结果：HS组织中乳酸水平显著升高；代谢组学显示糖酵解代谢物磷酸烯醇式丙酮酸及乳酸明显上调，而三羧酸循环中间产物柠檬酸减少，提示有氧糖酵解转换。RT-qPCR与Western blot证实HS中糖酵解基因（LDHA、HK2、PKM2、PFKFB3）及乳酸转运基因（MCT1、MCT4）显著上调，而氧化磷酸化基因（PDHA1、IDH1、IDH2）下调。IHC与IF显示MCT1在HS组织中高表达，且与肌成纤维细胞标志物α-SMA存在显著共定位；HSFs中MCT1 mRNA水平亦显著高于NSFs。

（3）关键结论：HS组织存在显著的糖酵解代谢重编程及乳酸累积，MCT1在肌成纤维细胞中特异性上调，提示其可能通过介导乳酸转运参与HS纤维化进程。

2.巨噬细胞是瘢痕代谢微环境中乳酸蓄积的主要来源

（1）主要方法：利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）水凝胶构建2kPa（生理软基质）与50kPa（病理性硬基质）体外力学模型，对THP-1巨噬细胞、HUVECs及NSFs进行培养；结合乳酸比色测定、SeahorseXF细胞外酸化率（ECAR）实时监测、ATP产生率计算、磁激活细胞分选（MACS）分离原代细胞、免疫荧光共染色（CD68与HK2/LDHA）及氯膦酸盐脂质体体内巨噬细胞耗竭实验。

（2）核心结果：在50kPa硬基质还是TGF-β刺激下，仅巨噬细胞表现出显著的胞外乳酸分泌与胞内乳酸产生增加，ECAR、糖酵解能力及糖酵解储备升高，且糖酵解来源ATP（glycoATP）超过氧化磷酸化来源ATP（mitoATP）。内皮细胞与成纤维细胞无显著乳酸变化。原代HS巨噬细胞同样显示乳酸产生增加及ECAR升高。HS组织中CD68+巨噬细胞的HK2与LDHA荧光强度显著增强，而肥大细胞（Tryptase⁺）及T细胞（CD3⁺）无此现象。体内氯膦酸盐脂质体耗竭巨噬细胞后，瘢痕组织乳酸水平显著下降。

（3）关键结论：巨噬细胞是HS纤维化微环境乳酸的主要来源，力学微环境与TGF-β驱动其代谢重编程。

3.巨噬细胞来源的乳酸蓄积通过MCT1促进皮肤真皮成纤维细胞的表型重塑

（1）主要方法：收集不同基质或TGF-β刺激下THP-1巨噬细胞及HUVECs的条件培养基（CM），刺激NSFs；采用MCT1选择性抑制剂AZD3965及LDHA抑制剂草氨酸（Oxamate）进行干预；通过Western blot、免疫荧光、划痕愈合实验、Ki-67增殖实验、Transwell迁移实验及RT-qPCR评估成纤维细胞表型变化。

（2）核心结果：50kPa硬基质诱导的巨噬细胞条件培养基显著促进NSFs中纤维化标志物（COL1A1、COL3A1、α-SMA）表达、细胞增殖与迁移，并上调促纤维化基因（Fibronectin、SPARC、POSTN、TNC、CD248、SMAD2）mRNA水平。AZD3965阻断MCT1或Oxamate抑制乳酸生成均可显著逆转上述效应。TGF-β刺激的巨噬细胞CM同样通过MCT1依赖途径促进纤维化，而内皮细胞条件培养基（EC-CM）无显著作用。

（3）关键结论：巨噬细胞来源的乳酸通过MCT1转运进入成纤维细胞，驱动其向肌成纤维细胞的表型转化，证实MCT1是代谢微环境调控纤维化的关键节点。

4.HS肌成纤维细胞中组蛋白乳酸化升高且H3K23la特异性上调

（1）主要方法：分离组蛋白，随后通过Western blot检测全局泛赖氨酸乳酸化（PanKla）及多位点特异性组蛋白乳酸化（H3K9la、H3K14la、H3K18la、H3K23la、H3K27la、H4K5la、H4K12la）；利用免疫荧光共染色，比较H3K23la在血管内皮细胞（CD31⁺）、巨噬细胞（CD68⁺）及肌成纤维细胞（α-SMA⁺）中的分布；并对比NSFs与HSFs中的乳酸化水平。

（2）核心结果：HS组织升高；仅H3K23la位点特异性升高，且只在肌成纤维细胞中富集，内皮与巨噬细胞无差异。

lHS组织中总乳酸化（PanKla）水平显著升高，且在组蛋白位置出现特征性条带。在多种组蛋白乳酸化位点中，仅H3K23la在HS组织中特异性显著上调。免疫荧光显示，HS与NS组织中CD31⁺内皮细胞及CD68⁺巨噬细胞的H3K23la强度无显著差异，但HS中α-SMA⁺肌成纤维细胞的H3K23la信号显著增强。Western blot证实HSFs中PanKla与H3K23la蛋白水平均显著高于NSFs，且外源乳酸以剂量依赖性方式提升H3K23la。

（3）关键结论：H3K23la是HS肌成纤维细胞中特异性升高的表观遗传修饰标志，提示其可能作为乳酸介导的纤维化调控的关键分子开关。

5.H3K23la在增生性瘢痕中激活HEY2和COL11A1的转录

（1）主要方法：采用CUT&Tag技术进行全基因组染色质结合分析，联合RNA-seq转录组测序；通过生物信息学交集分析筛选下游靶基因；利用ChIP-qPCR验证H3K23la在靶基因启动子区的富集；结合RT-qPCR、Western blot、IHC及免疫荧光共染色验证HEY2与COL11A1的表达。

（2）核心结果：HS组织中共鉴定出16,860个差异H3K23la结合峰，其中上调峰中25.26%位于基因启动子区。GO与KEGG分析显示，上调峰显著富集于碳水化合物衍生物生物合成、成纤维细胞迁移正调控、TGF-β信号通路。CUT&Tag与RNA-seq联合分析筛选出21个共同上调的候选靶基因，其中HEY2与COL11A1在HS中既表现出启动子区H3K23la富集增加，又伴随mRNA显著上调。ChIP-qPCR证实HEY2与COL11A1启动子区H3K23la修饰在HS中显著增强；Western blot与IHC显示二者蛋白水平在HS组织中显著升高，且与H3K23la共定位增强。

（3）关键结论：H3K23la直接转录激活HEY2与COL11A1，二者是乳酸-表观遗传通路的关键下游靶基因。

6.HEY2与COL11A1高表达介导成纤维细胞表型重塑

（1）主要方法：通过RT-qPCR与免疫荧光共染色检测HSFs与NSFs中的表达差异；siRNA转染特异性敲低HSFs中HEY2或COL11A1，并利用Western blot、免疫荧光、划痕愈合实验及Transwell迁移实验评估纤维化表型逆转情况。

（2）核心结果：HSFs中HEY2与COL11A1的转录水平显著高于NSFs，且二者与α-SMA在HS组织肌成纤维细胞中存在显著共定位。siRNA敲低HEY2或COL11A1后，HSFs中纤维化标志物（COL1A1、COL3A1、α-SMA）的蛋白表达显著下调；免疫荧光显示α-SMA与COL1A1荧光信号减弱；划痕愈合与Transwell实验证实细胞迁移能力显著降低，Ki-67增殖实验显示增殖能力受抑。

（3）关键结论：HEY2与COL11A1是成纤维细胞活化的关键效应分子，抑制其表达可有效逆转纤维化表型。

7.HEY2通过上调YAP1表达促进成纤维细胞表型重塑

（1）主要方法：整合GTEx、FIMO、JASPAR及GTRD数据库进行生信数据挖掘，筛选HEY2潜在下游靶基因；采用RT-qPCR检测YAP1在HS与NS中的表达；利用Pearson相关性分析验证HEY2与YAP1的关联；通过ChIP-qPCR验证HEY2与YAP1启动子的直接结合；结合siRNA敲低HEY2后的Western blot与免疫荧光共染色（SMAD2/P-SMAD2与α-SMA）分析YAP1/SMAD2通路活性。

（2）核心结果：生信分析鉴定YAP1为HEY2的潜在靶基因；HS组织中YAP1mRNA显著上调，且GTEx数据显示HEY2与YAP1表达呈显著正相关。JASPAR数据库预测YAP1启动子区域存在3个HEY2结合位点，ChIP-qPCR证实HEY2可直接结合于YAP1启动子。敲低HEY2显著降低YAP1、SMAD2及磷酸化SMAD2（P-SMAD2）蛋白水平；免疫荧光显示HEY2沉默后SMAD2/P-SMAD2与α-SMA的荧光强度同步减弱。主要

（3）关键结论：HEY2通过YAP1/SMAD2通路促进纤维化，构成关键促纤维化信号轴。

8.COL11A1通过与MCT1结合加剧成纤维细胞内乳酸蓄积

（1）主要方法：基于BioGRID数据库预测COL11A1互作蛋白；采用Co-IP验证蛋白相互作用；通过免疫荧光共定位分析NSFs与HSFs中COL11A1与MCT1的空间关系；利用AlphaFold3预测蛋白结构，AutoDockVina进行分子对接，Gromacs进行分子动力学模拟（100ns），gmx_MMPBSA计算结合自由能；构建COL11A1与MCT1点突变体进行Co-IP验证；通过外源乳酸补充实验检测COL11A1对胞内乳酸水平的影响。

（2）核心结果：COL11A1与MCT1直接相互作用并稳定其构象；增强乳酸转运与胞内积累；形成正反馈循环。

（3）关键结论：COL11A1稳定MCT1并强化乳酸摄取，构成乳酸-H3K23la-COL11A1-MCT1病理性正反馈环路。

9.成纤维细胞特异性Mct1敲除加速小鼠创面愈合并减轻胶原沉积

（2）核心结果：与对照组相比，Mct1条件性敲除小鼠伤口愈合速度显著加快，瘢痕尺寸减小，胶原沉积面积减少，胶原纤维排列更为规则，I/III型胶原比例显著降低，且表皮结构更完整并伴毛囊再生迹象。外源NaLac处理可部分恢复上述纤维化表型。免疫荧光显示Mct1敲除组织中α-SMA与H3K23la信号显著减弱；Western blot证实Col1a1、Col3a1、α-SMA、Col11a1及Hey2蛋白水平均显著下调。

（3）关键结论：成纤维细胞特异性Mct1缺失可有效打断乳酸驱动的表观遗传-纤维化轴，加速伤口愈合并减轻瘢痕形成，从遗传学层面证实MCT1是HS治疗的关键靶点。

10.通过药物抑制MCT1或清除巨噬细胞作为瘢痕治疗策略

（1）主要方法：在C57BL/6小鼠全层皮肤缺损模型中，采用AZD3965进行MCT1药理学抑制，并联合NaLac处理；同时设置氯膦酸盐脂质体巨噬细胞耗竭组；通过伤口动态拍照、H&E、Masson、Siriusred染色及免疫荧光评估抗瘢痕疗效。

（2）核心结果：AZD3965处理显著加速伤口愈合，减少瘢痕组织面积，降低胶原沉积，改善胶原纤维排列，并降低I/III型胶原比例；免疫荧光显示AZD3965显著降低α-SMA表达，而外源NaLac可逆转该保护效应。此外，晚期伤口阶段给予氯膦酸盐脂质体耗竭巨噬细胞，可显著减少瘢痕形成、降低乳酸水平并促进毛囊再生。

（3）关键结论：抑制MCT1或减少乳酸主要来源（巨噬细胞）均可有效干预瘢痕，均能有效减轻病理性瘢痕，为HS的临床治疗提供了双重靶向策略。